韋 達(dá)， 黃 青， 何華奇

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.中國(guó)科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031)

靈芝(Ganodermalingzhi)在真菌分類上屬于擔(dān)子菌門(mén)傘菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬真菌[1-2]。早在兩千多年前，就將其作為上品滋補(bǔ)藥材應(yīng)用于治病保健，由于靈芝具有特殊的藥用價(jià)值，其有效成分的分析及藥理作用研究己引起了國(guó)際上的關(guān)注[3]。目前，對(duì)靈芝的研究己逐漸深入到分子水平，這些研究在靈芝保健功能、抗衰老機(jī)理和防癌抗癌研究試驗(yàn)方面成績(jī)顯著[4-6]。其中靈芝多糖是靈芝主要有效成分之一，研究表明靈芝多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基等具有清除能力，具有抗氧化的作用[7]。多糖能提高抗體生成從而調(diào)節(jié)體液免疫和促進(jìn)產(chǎn)生免疫細(xì)胞因子的作用[8-9]。靈芝多糖能激活宿主細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)，也被用于臨床抗腫瘤治療[10]。

常壓室溫等離子體(atmospheric room-temperature plasma，ARTP)，具有自身作用時(shí)間短、無(wú)污染等特點(diǎn)，在誘變、滅菌等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[11]。ARTP中包含著大量的活性物質(zhì)(如自由電子、中性粒子、超氧化物、過(guò)氧化物、羥基自由基等)，這些活性物質(zhì)對(duì)生物體會(huì)產(chǎn)生影響，可以促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致生理活性發(fā)生變化[12]。劉京華等[13]利用介質(zhì)阻擋放電誘變雨生紅球藻獲得蝦青素積累量較高的新品系，王純陽(yáng)等[14]利用低溫低氣壓等離子體處理水稻種子，研究發(fā)現(xiàn)等離子體在一定條件下能夠提高水稻種子生長(zhǎng)活力。駱美潔等[15]利用ARTP處理玉米種子以及花粉,處理30 min幼苗顯著增長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)了幼苗干物質(zhì)積累增加了干重。蔣佳峰等[16]用低溫等離子體處理小麥種子，結(jié)果表明低溫等離子體處理能促進(jìn)小麥生長(zhǎng)，提高小麥產(chǎn)量。

本研究利用等離子體處理靈芝菌絲體，探討等離子體對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)速度、生物量和靈芝多糖含量的影響，為提高靈芝菌絲體產(chǎn)量以及品質(zhì)提升提供新途徑和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

赤芝菌種，由中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所保藏，提供并鑒定。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，稱取46 g PDA培養(yǎng)基加水至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min，倒入平板冷卻,放入37 ℃培養(yǎng)箱中24～48 h，檢查是否滅菌完全。

PDB培養(yǎng)基：土豆粉15 g/L煮熟雙層紗布過(guò)濾、MgSO40.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、葡萄糖20 g/L、pH自然。121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻待用。

PDA 蒽酮、硫酸、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 在超凈工作臺(tái)中，將靈芝菌種接種若干PDA培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，待菌絲長(zhǎng)滿備用。

1.2.2 培養(yǎng)靈芝菌絲體 無(wú)菌條件下，將平板中的菌塊接至滅菌后的液體培養(yǎng)基中，于28 ℃，180 rpm/min轉(zhuǎn)速搖床震蕩培養(yǎng)7 d，得到靈芝菌絲體。

1.2.3 ARTP處理 本實(shí)驗(yàn)在中科院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所完成，ARTP采用介質(zhì)阻擋放電等離子體(dielectric barrier discharge plasma，DBDP)，等離子體發(fā)生裝置見(jiàn)圖1。無(wú)菌條件下，從長(zhǎng)滿菌絲的 PDA 斜面中取5 mm2大小菌塊若干，分別置于φ=2 cm的石英等離子體反應(yīng)皿中，將介質(zhì)阻擋反應(yīng)探棒置于菌塊上方1 mm處，封閉反應(yīng)體系，通入氦氣4～6 min，氣體流量2 L/min；電壓為13 kV，放電時(shí)間0～4 min，對(duì)靈芝菌絲體進(jìn)行處理[17]。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。挑取液體培養(yǎng)的菌絲體，置于滅菌的勻漿器中，反復(fù)按壓，制成菌絲勻漿。用移液槍吸取1 mL勻漿置于φ=2 cm 的石英等離子體反應(yīng)皿中，ARTP條件同上。

圖1 介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體(DBD-LTP)實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 菌絲體生長(zhǎng)速度的測(cè)定 無(wú)菌條件下，將處理后將菌塊接種于PDA平板上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)，用記號(hào)筆畫(huà)出菌落生長(zhǎng)范圍，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[18]，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度(cm/d)，每株3 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 菌絲體生物量的測(cè)定 無(wú)菌條件下，將處理后接種于PDB培養(yǎng)基中，等菌絲長(zhǎng)滿后用無(wú)菌水反復(fù)洗滌3次，冷凍干燥得到靈芝菌絲凍干粉，用分析天平測(cè)定菌絲體干重，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 靈芝多糖的測(cè)定 蒽酮-硫酸法測(cè)定靈芝多糖[19]：精密量取0.12 mg/mL葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于試管中，加水至2.0 mL。加入6 mL2.5 mg/mL的硫酸蒽酮溶液，搖勻，15 min后，冰浴15 min。于625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得回歸方程Y=5.005X+0.234 9，R2=0.999 4,說(shuō)明糖濃度在規(guī)定范圍內(nèi)線性良好。供試品溶液的制備：精確稱定取菌絲凍干粉0.1 g，加水4 mL，靜置1 h，80 ℃水浴3 h，3 500 rpm/min離心5 min，留上清液待測(cè)。精確量取供試品溶液2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP處理對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)速率的影響

ARTP處理對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)速率影響見(jiàn)圖2所示。ARTP處理 0～2 min，菌絲生長(zhǎng)速率高于對(duì)照組，其中處理0.5 min的菌絲生長(zhǎng)最快，比對(duì)照組提高了9.96%。ARTP處理 3、4 min 生長(zhǎng)速率低于對(duì)照組，表明等離子體處理既能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，也能抑制菌絲生長(zhǎng)，等離子體處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則不利于菌絲體的生長(zhǎng)。

2.2 ARTP對(duì)菌絲體生物量的影響

等離子體處理，靈芝菌絲體生物量見(jiàn)圖3所示，等離子體處理0～3 min，菌絲體干重比對(duì)照組均有所提高，其中處理1 min菌絲體干重最大，與對(duì)照組相比提高了25.03%。

圖3 ARTP處理對(duì)靈芝菌絲體干重的影響

2.3 等離子體處理對(duì)靈芝多糖含量的影響

ARTP靈芝多糖含量見(jiàn)圖4所示，ARTP 0～4 min，與對(duì)照組相比靈芝多糖含量均有所提高。其中ARTP 1 min，靈芝多糖含量最高，與對(duì)照組相比提高了44.66%。

圖4 ARTP處理對(duì)靈芝菌絲體多糖的影響

3 結(jié)論與討論

ARTP是一種應(yīng)用廣泛的菌種誘變方法。靈芝菌種經(jīng)適當(dāng)處理后，培養(yǎng)的菌絲體形態(tài)以及生長(zhǎng)速率均會(huì)發(fā)生改變，表明等離子體處理可能引起靈芝菌種某些生物狀態(tài)發(fā)生改變，而這一改變表明菌絲體所含的某些活性物質(zhì)如多糖含量也會(huì)發(fā)生改變。等離子體處理時(shí)間不同，對(duì)菌絲體影響也不同，通過(guò)單因素試驗(yàn)，優(yōu)化了等離子體處理時(shí)間。在設(shè)定的等離子體處理?xiàng)l件下，處理時(shí)間為1 min，生物量與對(duì)照組相比提高了25.03%，靈芝多糖含量與對(duì)照組相比提高了44.66%，有利于生物量積累以及靈芝多糖合成。

本研究考察了低溫ARTP處理對(duì)靈芝菌絲體干重和靈芝多糖含量的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)嘗試，獲得了一些提高生物量以及靈芝多糖含量的等離子體處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，采用低溫ARTP可以促進(jìn)靈芝菌絲生長(zhǎng)，增加菌絲體生物量、提高靈芝多糖含量，這是一種簡(jiǎn)單易行并且實(shí)用性強(qiáng)的方法，具有較好的應(yīng)用前景。另外本研究只對(duì)等離子體處理對(duì)靈芝菌絲體多糖含量的影響進(jìn)行考察，因而對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵過(guò)程中胞外多糖以及靈芝子實(shí)體多糖有待進(jìn)一步研究。