任 琦， 符布銀， 黃佳敏， 方 追， 劉欣超， 顧有方， 李文超*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.懷遠(yuǎn)縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 懷遠(yuǎn) 233400)

羊球蟲病是由艾美爾科艾美爾屬的多種球蟲寄生于羊腸黏膜上皮細(xì)胞引起的一種原蟲病，呈世界性分布[1]。臨床上以腹瀉、消瘦、貧血和發(fā)育不良為特征，尤其對(duì)羔羊危害較大，青年羊和成年羊多為亞臨床感染，可給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

迄今，羊球蟲的命名比較混亂，公認(rèn)的山羊球蟲有13個(gè)種，其中致病性較強(qiáng)的是雅氏艾美爾球蟲(E.ninakohlyakimovae)，阿氏艾美爾球蟲(E.arloingi)、山羊艾美爾球蟲(E.caprina) 和克氏艾美爾球蟲(E.christenseni)，其中E.arloingi是許多國(guó)家/地區(qū)山羊的優(yōu)勢(shì)蟲種[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)已有山羊E.arloingi流行情況的報(bào)道，但相關(guān)研究均采用傳統(tǒng)的鏡檢法。因山羊球蟲卵囊在形態(tài)上很相似，鏡檢法難以精確區(qū)分不同球蟲蟲種，而PCR方法能方便、快速且準(zhǔn)確的來鑒定蟲種，但目前國(guó)內(nèi)尚未見有E.arloingi分子流行病學(xué)方面的報(bào)道[5]。安徽省及其周邊的河南省、山東省和江蘇省，是我國(guó)傳統(tǒng)的肉羊養(yǎng)殖主要產(chǎn)區(qū)之一，但該區(qū)域肉羊球蟲病的發(fā)生比較普遍，給養(yǎng)羊業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。鑒于此，為了解安徽及周邊地區(qū)規(guī)模化山羊場(chǎng)E.arloingi感染情況，本研究擬對(duì)安徽及周邊省份山羊E.arloingi感染情況進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，為該病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年9～12月，從安徽省及周邊地區(qū)挑選了10個(gè)規(guī)?；窖驁?chǎng)隨機(jī)采集781份新鮮山羊糞便樣品，分別是六安市裕安區(qū)、阜陽(yáng)市臨泉縣、滁州市鳳陽(yáng)縣、蚌埠市固鎮(zhèn)縣、安慶市宿松縣、池州市貴池區(qū)、馬鞍山市當(dāng)涂縣、洛陽(yáng)市洛寧縣、泰安市岱岳區(qū)、徐州市邳州市。上述樣品每份取30 g，分別裝入干凈塑封袋中，標(biāo)記好采集地、年齡等信息，帶回實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.2 樣品基因組DNA提取

參照糞便DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照Kawahara等[7]和Khodakaram-Tafti等[3]的引物，根據(jù)E.arloingi的ITS-1基因序列設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)出2對(duì)引物。第1對(duì)引物為Genus-common F: 5′-GCAAAAGTCGTAACACGGTTTCC-3′, Genus-common R: 5'-CTGCAATTCACAATGCGTATCG-3'，第2對(duì)引物為E.arloingiF: 5′-GGGTATCATCTATCCATTACATCC-3′，E.arloingiR:5′-GCACGCCTGATTGGTGTAGAAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為392 bp。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 ITS-1基因擴(kuò)增

參照Khodakaram-Tafti等[3]的方法進(jìn)行。兩輪PCR反應(yīng)條件相同，均為預(yù)變性94 ℃，5 min；再經(jīng)過35個(gè)循環(huán)：94 ℃，45 s；55 ℃，1 min；72 ℃，1 min；最后延伸至72 ℃，5 min。

1.5 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)、測(cè)序與分析

第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。所獲序列經(jīng)Blast搜索，利用Clustal X 1.81進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega 5.05采用鄰接法 (Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹，自展值(bootstrap)設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 E. arloingi ITS-1基因PCR擴(kuò)增

781份樣品共擴(kuò)增出54份E.arloingi陽(yáng)性樣品，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為392 bp，符合預(yù)期(圖1)。安徽及周邊地區(qū)山羊E.arloingi的感染率為6.91%。其中，E.arloingi感染主要分布在蚌埠(11.11%)，洛陽(yáng)(11.00%)、阜陽(yáng)(8.33%)、安慶(8.26%)、滁州(7.27%)、池州(5.63%)、馬鞍山(5.00%)、泰安(4.17%)和徐州(1.35%)，六安未檢出E.arloingi陽(yáng)性樣品 (表1)。

圖1 E.arloingiITS-1 基因PCR擴(kuò)增部分結(jié)果

2.2 遺傳發(fā)育分析

本試驗(yàn)獲得的54個(gè)E.arloingi陽(yáng)性樣品經(jīng)測(cè)序，共有50個(gè)測(cè)序成功，序列分析及Blast搜索比對(duì)顯示這50個(gè)ITS-1基因序列一致性為100%，與GenBank中的E.arloingiITS-1基因序列(KC507793)的同源性也為100 %，顯示所有擴(kuò)增產(chǎn)物均為E.arloingiITS-1基因?；贗TS-1基因進(jìn)化樹顯示反芻動(dòng)物不同種球蟲ITS-1基因序列分別處在2個(gè)進(jìn)化枝上，其中，本試驗(yàn)所得序列與已報(bào)道的E.arloingiITS-1基因(KC507793)位于同一個(gè)分支，該分支與由E.bovis、E.zuernii和分離自歐洲的一株E.arloingi形成的分支構(gòu)成“姊妹群”，共同構(gòu)成一個(gè)大分支，而其他反芻動(dòng)物艾美爾屬球蟲則組成另一獨(dú)立的大分支(圖2)。

表1 安徽及周邊省份山羊E.arloingi感染情況

圖2 基于ITS-1基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(鄰接法)

Fig.2 Dendrograms of the ITS-1 gene (N-J method)

▲ 代表本研究中擴(kuò)增得到的ITS-1序列

3 結(jié)論與討論

山羊球蟲感染較為普遍，但因獲得球蟲純種較為困難、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成本高等原因，相對(duì)雞球蟲研究而言，山羊球蟲的研究較為滯后。迄今，卵囊的形態(tài)學(xué)觀察仍然是區(qū)分羊球蟲蟲種的主要方法，但該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且不準(zhǔn)確[8]。PCR技術(shù)因其具有操作簡(jiǎn)單，快速，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，已被用于不同種球蟲蟲種的鑒別，目前常用的靶基因主要有ITS和18S rDNA基因[7-9]。本研究利用基于E.arloingiITS-1基因的巢式PCR對(duì)安徽及周邊地區(qū)山羊E.arloingi感染情況進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，以期為我國(guó)羊球蟲病的研究提供參考。

E.arloingi是許多國(guó)家/地區(qū)如荷蘭、馬來西亞、伊朗等山羊感染的優(yōu)勢(shì)蟲種，其中，埃及山羊E.arloingi感染率為37.04%，土耳其為47.43%，澳大利亞為8.8%，巴西為88%[10-14]。國(guó)內(nèi)多個(gè)省份如北京、陜西等也有山羊感染E.arloingi的相關(guān)報(bào)道，感染率約在13.00%～46.10%[4]。本研究中，安徽及周邊地區(qū)山羊E.arloingi的感染率為6.91%，除六安未檢測(cè)到該蟲種外，其余采樣點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)有E.arloingi感染。本研究結(jié)果低于國(guó)內(nèi)外其他的研究結(jié)果，分析其原因，可能主要與以下因素相關(guān)。一是國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究均采用傳統(tǒng)的鏡檢法，該方法主要依賴于對(duì)球蟲卵囊形態(tài)的識(shí)別，而臨床上山羊球蟲感染均為混合感染，且不同種的球蟲卵囊大小存在重疊，鏡檢觀察時(shí)很容易把其他球蟲卵囊誤認(rèn)為E.arloingi卵囊，進(jìn)而導(dǎo)致高估E.arloingi的實(shí)際流行情況所致[6]。二是本研究?jī)H對(duì)每個(gè)羊場(chǎng)采樣一次，但球蟲卵囊具有間歇排泄的特點(diǎn)，且其感染受季節(jié)的影響較大，可能采樣的時(shí)機(jī)也對(duì)感染率有較大的影響[4]。三是本次采樣的羊場(chǎng)均為規(guī)?；窖驁?chǎng)，飼養(yǎng)管理相對(duì)較完善，衛(wèi)生條件較好，而且這些羊場(chǎng)均定期進(jìn)行驅(qū)蟲，可能也是本次調(diào)查感染率較低的一個(gè)原因。最后，因本次采集的大多數(shù)是成年山羊，成年山羊在生長(zhǎng)過程中不可避免的要接觸球蟲卵囊，進(jìn)而對(duì)球蟲產(chǎn)生了免疫保護(hù)，導(dǎo)致不易再次感染或再次感染時(shí)卵囊產(chǎn)量較低[15]?？紤]到影響球蟲感染率的因素較多，未來還需要做進(jìn)一步的研究來闡明影響E.arloingi流行的主要因素，為生產(chǎn)中山羊球蟲病的防控提供依據(jù)。