王英燕, 陳文娜, 賈存江, 房樹(shù)標(biāo), 秦斌, 朱正喬

江蘇神華藥業(yè)有限公司, 江蘇 淮安 211600

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，最早由Hartsen于1873年從莓果中分離發(fā)現(xiàn)，為結(jié)晶性深紅色色素[1]。番茄紅素在自然界中的西瓜、南瓜、李子、柿子、胡蘿卜等果蔬中都有存在，但天然含量較低，其在成熟的紅色果實(shí)中含量較高，其中含量最高的是番茄，僅30～140 mg·kg-1[2-5]。番茄紅素具有很好的抗氧化、抗衰老、提高免疫力等功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[6-8]。

目前，番茄紅素的生產(chǎn)方法主要包括天然提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。天然提取法番茄紅素產(chǎn)量低，成本高且受制于原料來(lái)源；化學(xué)合成法存在安全隱患；而微生物發(fā)酵法具有工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高、生物活性與天然植物提取物一致等優(yōu)點(diǎn)[9-11]，越來(lái)越受到關(guān)注。

已知的可用于發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的微生物有經(jīng)基因改造的酵母菌[12]、紅色細(xì)菌[13]、革蘭氏陰性非光合菌[14]及三孢布拉氏霉菌。三孢布拉霉是國(guó)內(nèi)外唯一能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)胡蘿卜素的菌株，而番茄紅素是胡蘿卜素發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的中間產(chǎn)物，因此，三孢布拉霉是番茄紅素發(fā)酵生產(chǎn)的理想菌株[15]。本研究利用液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)，采用三孢布拉氏霉菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，優(yōu)化發(fā)酵中間過(guò)程參數(shù)，旨在進(jìn)一步提高番茄紅素的發(fā)酵產(chǎn)量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 三孢布拉氏霉菌正菌(+)和負(fù)菌(-)，由本公司菌種保藏中心篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：淀粉6%、葡萄糖1%、黃豆餅粉3%、亞油酸0.001%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.025%、維生素B1 0.001%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉4.5%、葡萄糖1.8%、玉米漿2.5%、黃豆餅粉2.8%、磷酸二氫鉀0.4%、硫酸鎂0.02%、維生素B1 0.002%。

1.1.3 試劑 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；淀粉、葡萄糖購(gòu)自南京京潤(rùn)生物科技有限公司；花生油、菜籽油、玉米油購(gòu)自山東魯花集團(tuán)有限公司；黃豆餅粉、大豆油購(gòu)自阜豐集團(tuán)有限公司；維生素B1購(gòu)自蘇州卓鑫生物科技有限公司；吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑、亞油酸、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、石油醚、二氯甲烷(均為分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司)；MS304S分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；GZX-GFC101-1-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；GWA-UN1F-F10超純水機(jī)(上海普析分析儀器有限公司)；HYG恒溫?fù)u瓶柜(上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司)；AWD-ZN-10L全自動(dòng)滅菌發(fā)酵罐(浙江百力仕龍野輕工裝備有限公司)；CL5R大容量冷凍離心機(jī)(上海圣科儀器設(shè)備有限公司)；UV1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津儀器(蘇州)有限公司]；HTZ-6020L數(shù)顯真空干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.3 番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

三孢布拉氏霉菌正菌株和負(fù)菌株分別活化后在28 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)48 h。隨后先將負(fù)菌株按一定比例接入發(fā)酵罐培養(yǎng)，24 h后再將正菌株按一定比例接入發(fā)酵罐培養(yǎng)。發(fā)酵42 h時(shí)，添加代謝流阻斷劑，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量、番茄紅素含量。當(dāng)番茄紅素含量不再增加，發(fā)酵終止。發(fā)酵前期攪拌速度設(shè)定為200 r·min-1，42 h后攪拌速度設(shè)定為280 r·min-1。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程通風(fēng)比1∶0.6；溫度28 ℃。

1.4 番茄紅素的定量檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品2 g，利用20 mL二氯甲烷溶解后用石油醚定容至100 mL，迅速將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1)于502 nm處測(cè)定吸光度，繪制番茄紅素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

將發(fā)酵液離心(4 000 r·min-1,5 min)用超純水洗滌3次，105 ℃恒定質(zhì)量后稱重，計(jì)算菌體生物量[17]。洗滌后的菌體在40 ℃真空干燥后研磨破壁，用石油醚萃取至溶液無(wú)色，合并萃取液轉(zhuǎn)入棕色容量瓶中，用石油醚定容。以石油醚為參照在502 nm處測(cè)定吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出番茄紅素含量[18]。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1 正負(fù)菌株接種比例對(duì)番茄紅素合成的影響 三孢布拉氏霉菌分為正菌和負(fù)菌，只有2種菌混合培養(yǎng)時(shí)才能獲得高產(chǎn)量的番茄紅素，負(fù)菌是主要的生產(chǎn)菌，正菌作為配對(duì)菌株提供三孢酸等激素刺激負(fù)菌中番茄紅素合成[19]。正負(fù)菌接種比例對(duì)發(fā)酵液中菌絲體形態(tài)有較大影響，增加負(fù)菌在混合培養(yǎng)過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)，可以提高番茄紅素的產(chǎn)量[20]。選擇1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1負(fù)正菌株接種比例進(jìn)行接種培養(yǎng)，考察接種比例不同對(duì)番茄紅素合成的影響。

1.5.2 代謝流抑制劑對(duì)番茄紅素合成的影響

在三孢布拉氏霉菌的代謝過(guò)程中，最終產(chǎn)物是β-胡蘿卜素而不是番茄紅素，而β-胡蘿卜素是由番茄紅素經(jīng)過(guò)番茄紅素環(huán)化酶的催化生成，為獲得大量番茄紅素，必須抑制番茄紅素環(huán)化酶活性。通過(guò)添加抑制劑的方法阻斷番茄紅素向β-胡蘿卜素的環(huán)化反應(yīng)，進(jìn)而提高番茄紅素的生物合成轉(zhuǎn)化率，含氮類雜環(huán)化合物(如吡啶、咪唑及其衍生物)均具有阻斷作用[21-23]。分別選用0.05 g·L-1的吡啶、咪唑、2,6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑4種阻斷劑，考察其對(duì)番茄紅素發(fā)酵的影響。

1.5.3 外源性植物油對(duì)番茄紅素合成的影響

在番茄紅素發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，外源性植物油被菌體分泌的胞外脂肪酶分解吸收，菌體內(nèi)脂肪酸飽和度增加，其分解產(chǎn)物乙酰輔酶A不僅可進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，還可作為脂肪和番茄紅素合成的共同前體物質(zhì)[24]。分別選用3 g·L-1的大豆油、菜籽油、花生油、玉米油作為外源性植物油，考察其對(duì)菌體生物量和番茄紅素產(chǎn)量的影響。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

在采用響應(yīng)面分析法時(shí)，實(shí)驗(yàn)中得到的響應(yīng)面擬合方程在靠近番茄紅素最高產(chǎn)區(qū)才能較好地反映真實(shí)情況，所以應(yīng)該先逼近最高番茄紅素產(chǎn)區(qū)后再建立有效的擬合方程。根據(jù)單因素法篩選出的顯著因子效應(yīng)設(shè)定它們的變化步長(zhǎng)，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，尋找最高番茄紅素產(chǎn)區(qū)。根據(jù)Box-Behnken原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)水平表Table 1 Response surface analysis experiment level table

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)據(jù)獨(dú)立進(jìn)行3次以上，利用Design-Expert、origin 8.5、Microsoft 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品2 g，用20 mL二氯甲烷溶解后再用石油醚定容至100 mL制成番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)液，將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)樣于502 nm處測(cè)定吸光度。如圖1所示，根據(jù)番茄紅素含量和吸光值的線性關(guān)系，建立番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出回歸方程：y=0.277 9x+0.038 2，R2=0.997 9。根據(jù)回歸方程R2可知，在0～3.0 g·L-1范圍內(nèi)，番茄紅素含量與吸光值具有良好的線性關(guān)系。

圖1 番茄紅素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正負(fù)菌株接種比例對(duì)番茄紅素合成的影響 為了考察三孢布拉氏霉菌正負(fù)菌株接種比例對(duì)番茄紅素合成的影響，發(fā)酵時(shí)，負(fù)菌∶正菌分別按比例1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1接種，發(fā)酵結(jié)束后，菌體生物量與番茄紅素產(chǎn)量如圖2所示?？梢钥闯?，接種比例過(guò)小，出現(xiàn)負(fù)菌生長(zhǎng)慢的劣勢(shì)；接種比例過(guò)大，導(dǎo)致正菌的生長(zhǎng)受阻，不能為負(fù)菌提供足夠的三孢酸等刺激物，從而導(dǎo)致番茄紅素產(chǎn)量下降。結(jié)果表明，負(fù)菌∶正菌接種比例8∶1時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量最高，達(dá)到1.22 g·L-1，因此，負(fù)菌∶正菌接種最佳比例為8∶1。

2.2.2 代謝流抑制劑對(duì)番茄紅素合成的影響

為了考察代謝流抑制劑對(duì)番茄紅素合成的影響，分別向培養(yǎng)基中添加0.05 g·L-1吡啶、咪唑、2，6-二甲基吡啶、2-甲基咪唑，CK為對(duì)照組(無(wú)添加)，發(fā)酵結(jié)束后，菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量如圖3所示?？梢钥闯?，不同抑制劑對(duì)番茄紅素合成轉(zhuǎn)化率影響不同，吡啶和咪唑的抑制效果比它們的衍生物差，效果最好的是2,6-二甲基吡啶，番茄紅素含量提高了62.5%。因此，選擇2,6-二甲基吡啶為最佳代謝流抑制劑。

2.2.3 外源性植物油對(duì)番茄紅素合成的影響

為了考察外源性植物油對(duì)番茄紅素合成的影響，分別向培養(yǎng)基中添加3 g·L-1大豆油、菜籽油、花生油、玉米油，CK為對(duì)照組(無(wú)添加)，發(fā)酵結(jié)

圖2 正負(fù)菌株接種比例對(duì)番茄紅素合成的影響Fig.2 Effect of the ratio of positive and negative strains on the concentration of lycopene

圖3 環(huán)化酶抑制劑對(duì)番茄紅素合成的影響Fig.3 Effect of different cyclase inhibitors on the concentration of lycopene

束后，菌體生物量及番茄紅素產(chǎn)量如圖4所示。可以看出，添加大豆油后單位菌體番茄紅素產(chǎn)量較其他實(shí)驗(yàn)組高，生物量提高了35.7%，番茄紅素含量提高了39.6%，這可能是因?yàn)榇蠖褂透缓瑏営退嵊欣谏锪康奶嵘?，促進(jìn)了番茄紅素的合成。綜合考慮，選擇大豆油作為外源性植物油輔助發(fā)酵。

圖4 外源性植物油對(duì)番茄紅素合成的影響Fig.4 Effect of different plant oils on the >concentration of lycopene

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化番茄紅素的發(fā)酵制備工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析 選取負(fù)正菌株體積比例(A)、2，6-二甲基吡啶濃度(B)、大豆油濃度(C)3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以番茄紅素的產(chǎn)量為響應(yīng)值；根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)了3因素3水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面中心組合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

運(yùn)用Design-Expert軟件分析表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，擬合出的方程模型為：

Y=1.41-0.027A+0.15B+0.071C-0.032AB+0.065AC-0.035BC-0.043A2-0.061B2-0.034C2

響應(yīng)面模型的方差分析如表3所示。由表3可知，一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)C2對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量有極顯著影響，二次項(xiàng)B2與交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)番茄紅素產(chǎn)量有顯著影響。說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的因素與番茄紅素的產(chǎn)量不是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。同時(shí)響應(yīng)面模型極度顯著，失擬項(xiàng)對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量影響不顯著，說(shuō)明非實(shí)驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)影響程度較低，可以用此模型進(jìn)行番茄紅素產(chǎn)量的模擬；系數(shù)R2為0.923 2，說(shuō)明該回歸模型與實(shí)際結(jié)果擬合較好。此外，一次項(xiàng)A對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量無(wú)顯著影響，但其在單因素實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的明顯影響，具體原因在后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中會(huì)繼續(xù)考察。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 二階回歸模型方差分析表Table 3 Table of variance analysis of second order regression model

注：*和**分別表示差異在P<0.05和P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 響應(yīng)面圖和等高線圖分析 考慮到番茄紅素的單位產(chǎn)量較其他發(fā)酵產(chǎn)品而言，產(chǎn)量較低且提高較困難，因此需要密切關(guān)注能夠促使其增產(chǎn)的一切因素。為了更直觀地反映各因素間交互作用顯著程度，根據(jù)回歸方程做出各因素對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖。其中，等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。從圖5可知，負(fù)正菌株接種比例、2,6-二甲基吡啶和大豆油的含量?jī)蓛山换プ饔脤?duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響均顯著，其響應(yīng)面圖對(duì)應(yīng)的等高線圖均呈橢圓。

圖5 影響番茄紅素產(chǎn)量的各因素響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response curves and contour map of the factors influencing lycopene yield

通過(guò)模型對(duì)培養(yǎng)基最優(yōu)配比的預(yù)測(cè)可知，當(dāng)培養(yǎng)基中負(fù)菌∶正菌體積比為6∶1、2，6-二甲基吡啶0.09 g·L-1、大豆油濃度3.57 g·L-1時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最大值(1.53 g·L-1)。用此工藝條件進(jìn)行5次發(fā)酵，實(shí)際平均發(fā)酵產(chǎn)量為1.51 g·L-1，菌體生物量51 g·L-1，說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3 討論

番茄紅素作為一種對(duì)人體有益的類胡蘿卜素，其抗癌抑癌、抗氧化性、細(xì)胞生長(zhǎng)代謝調(diào)控等特征在大健康及醫(yī)療領(lǐng)域?qū)?huì)產(chǎn)生巨大的作用。然而，傳統(tǒng)的提取方法和化學(xué)合成法無(wú)法滿足需求。微生物發(fā)酵法因具有工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)效率高、產(chǎn)物的生物活性與天然植物提取物一致等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到關(guān)注，但番茄紅素產(chǎn)量會(huì)根據(jù)發(fā)酵菌株的不同而變化。王敏等[25]以1株龜裂鏈霉菌為出發(fā)菌株經(jīng)誘變篩選及工藝優(yōu)化使番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到230 mg·L-1；汪福源等[26]通過(guò)誘變紅酵母，獲得可生物合成番茄紅素的RY-17菌株，其在優(yōu)化后的工藝條件下番茄紅素的產(chǎn)量?jī)H為5.53 mg·L-1；任龍[27]以三孢布拉霉為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)2次的誘變篩選，在最優(yōu)的工藝條件下番茄紅素的產(chǎn)量可達(dá)1.295 g·L-1。由此可見(jiàn)，三孢布拉霉是目前發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量最優(yōu)的菌株。

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化代謝控制條件，最終確定當(dāng)三孢布拉氏霉菌負(fù)正菌株接種比例6∶1，添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑2,6-二甲基吡啶0.09 g·L-1，以3.57 g·L-1大豆油為外源性植物油輔助發(fā)酵時(shí)，可使發(fā)酵液中的番茄紅素產(chǎn)量達(dá)1.51 g·L-1，菌體生物量51 g·L-1。本研究通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化可以使番茄紅素的產(chǎn)量穩(wěn)定的維持在1.5 g·L-1，相對(duì)于任龍[27]的研究，番茄紅素的產(chǎn)量提高了15個(gè)百分點(diǎn)，離番茄紅素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)更近一步。然而，利用發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量依舊較低，這意味著今后在提高番茄紅素產(chǎn)量的方面需要繼續(xù)探索，可通過(guò)外源添加提高產(chǎn)量，如維生素輔酶、還原力(NADP、NADPH)、前體、中間代謝產(chǎn)物的不斷優(yōu)化可能會(huì)使番茄紅素的產(chǎn)量繼續(xù)提高。