鄧春萌, 王啞倩, 吳美媛

1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.麗水學(xué)院, 浙江 麗水 323800

牛樟芝是一種寄生于臺灣特有樹種(牛樟樹)上的珍稀藥食兩用腐木真菌。據(jù)現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，牛樟芝含有三萜、多糖、超氧化物歧化酶、腺苷、蛋白質(zhì)、維生素和木質(zhì)素等多種生物活性物質(zhì)，其中以三萜類和多糖類物質(zhì)為主[1-3]，這兩類活性物質(zhì)具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗炎、抗氧化等功效[4-10]，但因其寄主專一性強(qiáng)且生長緩慢、數(shù)量稀少，所以十分珍貴[11-12]。牛樟芝菌絲體固態(tài)發(fā)酵是一種人工培養(yǎng)方式，可模擬牛樟芝生長環(huán)境,打破牛樟樹稀少的局限性，其發(fā)酵產(chǎn)物主要成分及代謝產(chǎn)物與牛樟芝子實(shí)體接近[13-16]，這為牛樟芝提取物的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。

正交試驗(yàn)法以概率論、數(shù)理統(tǒng)計及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)化正交表設(shè)計方案，能夠?qū)崿F(xiàn)快速優(yōu)化方案的目的，是一種目前較為常用的工藝優(yōu)化分析方法[17-19]。本文采用正交試驗(yàn)法分別對牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中主要的生物活性物質(zhì)三萜和多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體生物活性物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)，同時為其活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體(浙江方格藥業(yè)有限公司)；BSA124S-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；H2050R型臺式離心機(jī)(湖南湘儀公司)； DF-101SA-H型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(南京科爾儀器設(shè)備有限公司)；751紫外-可見分光光度計(上海分析儀器廠)。

1.2 三萜的提取工藝

稱取5 g牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體細(xì)粉置于燒杯中，加入一定比例90%乙醇，一定溫度下攪拌提取一定時間，離心收集上清液，過濾，溶液定容于250 mL容量瓶定容，備用。

1.3 三萜提取正交試驗(yàn)

按照1.2所述提取方法，采用L9(34)正交試驗(yàn)方法，設(shè)置浸提時間、料液比和提取溫度3個因素，每個因素3個水平，以三萜得率作為考察指標(biāo)，其因素與水平見表1，每組設(shè)置3次平行試驗(yàn)。

表1 三萜提取的因素與水平Table 1 Factors and levels of triterpene extraction

1.4 三萜含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取熊果酸10.00 mg，加入乙醇定容至100 mL，得到濃度為0.10 mg·mL-1的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL熊果酸對照樣液，分別加乙醇至2 mL，水浴揮干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，70 ℃水浴35 min，冰浴10 min，加入5.00 mL冰醋酸，搖勻后冷卻至室溫，并設(shè)置空白對照組。采用紫外-可見分光光度計于548 nm處測定吸光度值(A)，以熊果酸質(zhì)量濃度為X軸，A值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。

待測樣液檢測：將1.2中待測提取液稀釋一定比例按上述方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中三萜的濃度。

1.5 多糖的提取工藝

稱取5 g牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體細(xì)粉置于燒杯中，加入一定比例90%雙蒸水，一定溫度下攪拌提取一定時間，離心收集上清液，過濾，溶液于250 mL容量瓶定容，備用。

1.6 多糖提取的正交試驗(yàn)

按照1.5所述提取方法，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)置浸提時間、料液比和提取溫度3個因素，每個因素設(shè)置3個水平，以多糖得率作為考察指標(biāo)，其因素與水平見表2，每組設(shè)置3次平行試驗(yàn)。

表2 多糖提取的因素水平Table 2 Factors and levels of polysaccharides extraction

1.7 多糖含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，加入雙蒸水溶解定容至100 mL，得到濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞試管中，分別加水至2 mL，各加入5%的苯酚溶液1 mL混合均勻，加入濃硫酸5 mL，震蕩均勻，置于30 ℃水浴20 min，另以蒸餾水2 mL同上操作，為空白對照。于490 nm處測定吸光度(A)，以葡萄糖濃度為X軸，A值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]。

待測樣品檢測：將1.5中待測提取液稀釋一定比例按上述方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中多糖濃度。

1.8 提取得率的計算

三萜得率=三萜質(zhì)量/牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體細(xì)粉質(zhì)量×100%

多糖得率=多糖質(zhì)量/牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體細(xì)粉質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中三萜提取的正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)法考察了浸提時間、料液比和提取溫度對三萜提取含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3中R2值可知，3個因素的影響順序?yàn)锽>C>A，即料液比>提取溫度>浸提時間。由K值分析最佳提取條件為(A3B3C2)，由試驗(yàn)得率分析最佳提取條件為(A1B3C3)，兩個最佳提取條件不一致。

2.2 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中三萜提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

對K值分析最佳提取條件(A3B3C2)與得率試驗(yàn)最佳條件(A1B3C3)各進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，A3B3C2條件下提取的三萜得率為3.43%，A1B3C3條件下得率為3.30%，因此牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體三萜的最佳提取條件為A3B3C2，即浸提時間3 h、料液比1∶30 (g·mL-1)、溫度70 ℃,該條件下三萜得率為3.43%。

表3 三萜提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of triterpene extraction

2.3 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中多糖提取的正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)法考察了浸提時間、料液比和提取溫度對多糖提取含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4中R2值可知，3個因素的影響順序?yàn)锽>C>A，即料液比>提取溫度>浸提時間。由K值分析最佳提取條件為(A2B3C3)，由試驗(yàn)得率分析最佳提取條件為(A2B2C3)，兩個最佳提取條件不一致。

2.4 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中多糖提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

對K值分析最佳提取條件(A2B3C3)和試驗(yàn)得率分析最佳提取條件(A2B2C3)各進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，A2B2C3條件下提取的多糖得率為4.71%，A2B3C3條件下多糖得率為4.34%，因此牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體多糖的最佳提取條件為A2B2C3，即浸提時間2 h、料液比1∶20(g·mL-1)、溫度95 ℃,該條件下多糖得率為4.71%。

表4 多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of polysaccharides >extraction

3 討論

牛樟芝因含有三萜、多糖及超氧化物歧化酶等多種活性成分且在抗腫瘤、護(hù)肝及抗炎等方面具有良好功效而備受關(guān)注。黃紅雨等[20]采用響應(yīng)面試驗(yàn)法對牛樟芝三萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為：乙醇濃度 78%、提取時間 81 min、料液比1∶20 (g·mL-1)，得率為5.26%。呂莎等[6]采用效應(yīng)面法優(yōu)化牛樟芝三萜的提取條件，最佳提取條件為：加20倍量的90%乙醇，超聲提取2次，每次40 min，超聲功率 400 W，得率為11.87%。王宮等[21]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化牛樟芝多糖的提取工藝，最佳提取條件為：溫度 100 ℃，料水比1∶20 (g·mL-1)，提取時間2 h，得率為0.59%左右。楊彬君等[10]采用水提醇沉法提取牛樟芝多糖，得率為3.02%。但由于牛樟芝較為稀少珍貴，大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用成為難題[13,20]。

本研究以牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體粉末為提取材料，并采用正交試驗(yàn)法分別對其三萜和多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到三萜的最佳提取工藝為：浸提時間3 h、料液比1∶30 (g·mL-1)、溫度70 ℃，得率為3.43%，多糖的最佳提取工藝為：浸提時間2 h、料液比1∶20 (g·mL-1)、溫度95 ℃，得率為4.71%。本研究采用傳統(tǒng)提取方法，工藝簡單便于生產(chǎn)；與前人關(guān)于牛樟芝三萜和多糖的研究結(jié)果相比，牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體的三萜提取得率有所下降，多糖提取得率有所提升，分析可能與牛樟芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方式所得為菌絲體和培養(yǎng)基混合物相關(guān)[13]。本研究可為牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體生物活性物質(zhì)的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和活性研究提供參考。