李顏方, 王高鴻, 杜艷偉, 趙根有, 趙晉鋒

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所, 特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)試驗(yàn)室, 山西 長(zhǎng)治 046011

谷子是我國(guó)重要的區(qū)域性雜糧作物，最早起源于我國(guó)黃河流域和華北地區(qū)，它比小麥、玉米等主要糧食作物更能適應(yīng)非生物脅迫逆境條件[1-2]。谷子營(yíng)養(yǎng)豐富且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，被稱為“植物雞蛋”，具有特殊的醫(yī)療保健功能，可作為治療腹瀉的藥物[3]。隨著人們營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的增強(qiáng)，傳統(tǒng)育種技術(shù)已不能滿足大眾對(duì)高品質(zhì)谷子的需求，亟需利用組織培養(yǎng)和基因工程手段對(duì)谷子進(jìn)行功能基因研究從而提高谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)。

谷子功能基因的研究依賴于穩(wěn)定高效的離體再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。建立谷子快速高效的離體再生體系，在最短的時(shí)間內(nèi)改善谷子品質(zhì)，是生物技術(shù)應(yīng)用于谷子改良的第一步[4-6]。組織培養(yǎng)周期短、生長(zhǎng)速度快，可以最大限度地減少體細(xì)胞無性系變異[7]。有學(xué)者利用谷子的成熟胚和幼胚[8]、莖尖、幼穗[9]和中胚軸[10]等作為外植體，通過離體組織培養(yǎng)得到新的植株。但谷子的幼穗、幼胚、花藥生長(zhǎng)具有季節(jié)性，取材受到很大限制，而成熟胚卻不受時(shí)間和空間的影響，取材方便、花費(fèi)少，是組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體。

利用谷子成熟胚進(jìn)行離體再生的影響因素很多，包括基因型、生長(zhǎng)素濃度、細(xì)胞分裂素濃度和培養(yǎng)條件等[11-12]。谷子的組織培養(yǎng)具有很強(qiáng)的基因依賴性，選取高效的谷子基因型是首要前提。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA)和吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)是3種常用于組織培養(yǎng)的生長(zhǎng)素，其中2,4-D效果最為顯著，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，有助于新器官的分化和形成[13]。愈傷組織分化前進(jìn)行適當(dāng)?shù)母稍锾幚砜山档陀鷤M織含水量，造成愈傷細(xì)胞饑餓，從而促使細(xì)胞分化，提高愈傷組織的分化率[14]。郭向云等[15]對(duì)6個(gè)基因型的小麥幼胚愈傷組織干燥處理12 h后發(fā)現(xiàn)，鄭9023和濟(jì)麥2號(hào)的分化率比對(duì)照分別提高了25.0%和26.8%。本研究團(tuán)隊(duì)前期經(jīng)大量篩選獲得了愈傷誘導(dǎo)率較高的8份材料[16]，選取當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)高產(chǎn)的晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06等6個(gè)品種谷子成熟胚為外植體，研究不同2,4-D濃度、不同干燥處理時(shí)間對(duì)谷子愈傷組織分化及成苗的影響，進(jìn)而優(yōu)化谷子成熟胚離體再生體系，以期為后續(xù)谷子遺傳轉(zhuǎn)化和品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)基配方

本研究團(tuán)隊(duì)前期從216份谷子材料中篩選出8個(gè)愈傷誘導(dǎo)率較高的基因型[16]。選取6個(gè)當(dāng)?shù)爻Ｒ姷母弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)谷子品種(晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06、長(zhǎng)生07、長(zhǎng)生13、晉谷4號(hào))為材料，這些材料由山西農(nóng)科院谷子研究所提供。實(shí)驗(yàn)所用的初級(jí)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A)、胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(B)、分化培養(yǎng)基(C)和生根培養(yǎng)基(D)的配方參考李顏方等[16]的配方配制。

1.2 谷子成熟胚離體再生體系的建立

種子處理：稱取0.5 g種子，去除浮皮及不飽滿的種子，75%乙醇滅菌30 s，無菌去離子水清洗3次，每次30 s。隨后，于0.1% HgCl2溶液浸泡5 min，無菌去離子水清洗3次，每次5 min，處理后的種子置于無菌濾紙上吸干水分。

愈傷誘導(dǎo)：將處理過的種子接種于A培養(yǎng)基上，每皿50個(gè)。25 ℃暗培養(yǎng)。2周后將初級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移到B培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，每2周繼代1次。

分化再生：繼代2次后，選取質(zhì)地緊密、顏色淡黃、生長(zhǎng)良好的胚性愈傷組織接種于C培養(yǎng)基中，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)(光照強(qiáng)度3 000 lx，濕度65%)，1周左右愈傷組織表面出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。將帶有綠色芽點(diǎn)的分化組織轉(zhuǎn)接到D培養(yǎng)基，待再生幼苗長(zhǎng)出健壯根系后，煉苗3～5 d，移栽于花盆中室外培養(yǎng)。

參考Rathinapriya等[17]的方法，本研究以分化率和成苗率作為考察指標(biāo)。生成的胚性愈傷組織經(jīng)C培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化成綠色芽點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分化率;將綠色芽點(diǎn)移到D培養(yǎng)基中再生成綠色幼苗，煉苗后統(tǒng)計(jì)成苗率。

分化率/%=分化出綠點(diǎn)的愈傷組織塊數(shù)/總的愈傷組織塊數(shù)×100%

成苗率/%=分化成苗的植株數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%[18]

1.3 離體再生體系單因素實(shí)驗(yàn)

研究表明，谷子的基因型、施用的生長(zhǎng)素濃度以及培養(yǎng)條件等均會(huì)對(duì)離體再生體系的建立產(chǎn)生影響[11-12]。因此，本研究分別考察了不同的谷子品種、2,4-D濃度和愈傷組織干燥處理時(shí)間對(duì)離體再生體系的影響。

1.3.1 不同谷子品種對(duì)成熟胚離體再生體系的影響 選取晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06、長(zhǎng)生07、長(zhǎng)生13、晉谷4號(hào)這6個(gè)品種谷子的成熟種子按1.2方法進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 2,4-D處理對(duì)成熟胚離體再生體系的影響

將滅菌處理后的種子接種到含不同2,4-D濃度的A培養(yǎng)基，誘導(dǎo)初級(jí)愈傷組織，2周后轉(zhuǎn)接到相應(yīng)2,4-D濃度的B培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚性愈傷組織。2,4-D濃度分別為6、9、12、15 μmol·L-1，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 干燥處理時(shí)間對(duì)成熟胚離體再生體系的影響 在超凈工作臺(tái)中，將用于分化的胚性愈傷組織置于鋪有3層無菌干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，對(duì)愈傷組織進(jìn)行2、4、6、8 h的干燥處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4 離體再生體系正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇不同谷子品種成熟胚、不同濃度2,4-D以及不同干燥時(shí)間的4個(gè)水平，借鑒五因素四水平的L16(45)正交表[19]并進(jìn)行改良，設(shè)計(jì)16組平行實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)表Table 1 Table of orthogonal experiment

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件繪制圖表，采用DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)分化率、成苗率進(jìn)行F檢驗(yàn)和Duncan新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同谷子品種對(duì)成熟胚離體再生體系的影響

為了探究不同谷子品種對(duì)成熟胚離體再生體系的影響，選取6份谷子材料的成熟種子滅菌處理后分別在A培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，繼代2次后將長(zhǎng)勢(shì)良好、質(zhì)地致密的愈傷組織轉(zhuǎn)接到B培養(yǎng)基上，生成的淡黃色胚性愈傷組織經(jīng)C培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化成綠色芽點(diǎn)，移到D培養(yǎng)基中再生成綠色幼苗。在相同的培養(yǎng)條件下(2,4-D濃度為9 μmol·L-1，Kin濃度為4 μmol·L-1)，6個(gè)谷子品種成熟胚愈傷組織分化率為30.15%～54.23%，成苗率為11.13～25.36%(表2)，其中，晉谷21號(hào)的愈傷組織狀態(tài)最佳，呈淡黃色、半透明狀、質(zhì)地致密，成苗率為25.36%，成苗后生長(zhǎng)狀態(tài)也優(yōu)于其他品種，是相對(duì)理想的基因型。圖1展示了以晉谷21為代表的谷子成熟胚離體再生的過程。

基因型是影響谷子離體再生的重要因素，表2顯示6個(gè)谷子品種的分化率、成苗率存在差異，其中分化率的差異在P<0.05水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，成苗率的差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。晉谷21成熟胚的分化率與成苗率顯著優(yōu)于其他5個(gè)品種，長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06、長(zhǎng)生07次之，選取這4個(gè)品種用于后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)。綜上所述，不同品種谷子愈傷組織的分化成苗能力差異明顯，這與林國(guó)梁等[20]、余桂榮等[21]的研究結(jié)果一致。

2.2 不同2,4-D濃度對(duì)谷子成熟胚離體再生體系的影響

為了探究不同2,4-D濃度對(duì)谷子成熟胚離體再生體系的影響，選取晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06的成熟胚滅菌后分別置于2,4-D濃度為6、9、12、15 μmol·L-1的A、B培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由表3可知，同一谷子品種的分化率與成苗率隨著2,4-D濃度的增加，表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)2,4-D濃度為9 μmol·L-1時(shí)，愈傷分化率達(dá)到最高，晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06分別為47.90%、43.81%、40.25%，愈傷質(zhì)地致密呈淡黃色，且此濃度下成苗率也最高；當(dāng)2,4-D濃度為15 μmol·L-1時(shí)，愈傷組織的分化率下降，愈傷呈乳白色水漬狀，部分褐化明顯,綠色芽點(diǎn)明顯減少，成苗率隨之下降。對(duì)這3個(gè)品種的谷子而言，2,4-D的最適宜濃度為9 μmol·L-1，這與本研究團(tuán)隊(duì)前期建立谷子遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)的濃度篩選結(jié)果一致[16]。綜上所述，2,4-D作為影響谷子愈傷誘導(dǎo)重要的生長(zhǎng)激素，過高和過低均不利于愈傷組織的誘導(dǎo)。

表2 不同谷子品種對(duì)成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響Table 2 Effects of varieties on callus induction and differentiation of millet mature embryo

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示同列數(shù)據(jù)間的差異在P<0.05和P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:谷子成熟胚誘導(dǎo)的初級(jí)愈傷組織; B:次級(jí)愈傷組織; C:質(zhì)地緊密、狀態(tài)較好的胚性愈傷; D:愈傷組織分化出綠色芽點(diǎn); E:分化成小苗; F:練苗; G:移苗至成活圖1 谷子成熟胚離體再生的過程Fig.1 In vitro regeneration process of mature embryo of foxtail millet

表3 不同濃度2,4-D對(duì)谷子成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響Table 3 Effects of different concentration 2,4-D on callus induction and differentiation of millet mature embryo

注：表中小寫字母表示差異在P<0.05水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 干燥處理時(shí)間對(duì)谷子成熟胚離體再生體系的影響

為了探究不同干燥處理時(shí)間對(duì)谷子成熟胚離體再生體系的影響，將晉谷21的胚性愈傷干燥處理后用于分化再生培養(yǎng)。由圖2可知，不同干燥處理時(shí)間對(duì)愈傷組織分化產(chǎn)生的影響不同。干燥處理2 h，分化率較對(duì)照(干燥處理0 h)提高了12.37%，可能由于愈傷組織在干燥的濾紙上處于饑餓狀態(tài)，轉(zhuǎn)接到新鮮的C培養(yǎng)基上，可以快速吸收和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)分；干燥處理4 h，愈傷組織分化率為48.81%，達(dá)到峰值，成苗率為19.52%，也高于其他處理。干燥處理6 h，和對(duì)照相比差異不大；干燥8 h分化率較對(duì)照下降了9.13%。干燥處理后愈傷組織能較早分化出綠色芽點(diǎn)，出苗速度快，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。而對(duì)照的出苗速度慢，長(zhǎng)勢(shì)較弱。綜上所述，適度干燥處理可以提高成熟胚離體再生的分化率和成苗率，本研究中谷子愈傷組織分化前最佳干燥處理時(shí)間為4 h。

圖2 干燥處理時(shí)間對(duì)綠苗分化率及成苗率的影響Fig.2 Effects of drying time on the differentiation >and growth of green seedlings

2.4 品種、2,4-D濃度與干燥處理時(shí)間正交互作對(duì)谷子成熟胚離體再生的影響

為了研究谷子品種、2,4-D濃度與干燥處理時(shí)間正交互作對(duì)谷子成熟胚離體再生體系的影響，將谷子成熟胚、2,4-D以及干燥時(shí)間組成3個(gè)要素，設(shè)計(jì)16組平行試驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明(表4)，對(duì)谷子分化率的影響大小順序?yàn)镃>A>B,即干燥處理時(shí)間>品種類型>2,4-D濃度，其中干燥時(shí)間對(duì)谷子分化率的影響最大，其次是谷子品種和2,4-D濃度；對(duì)谷子成苗率的影響大小順序與分化率一致，即干燥處理時(shí)間>品種類型>2,4-D濃度，主要因?yàn)楣茸臃只偕且粋€(gè)連續(xù)體系，分化率高，成苗率也相對(duì)較高。通過正交實(shí)驗(yàn)篩選，處理2(A1B2C2)為最優(yōu)組合，即晉谷21的成熟胚在2,4-D濃度為9 μmol·L-1、干燥時(shí)間為4 h的處理?xiàng)l件下，能得到高效的離體再生體系，分化率為61.63%，成苗率為27.78%，高于其他處理?xiàng)l件下的分化率及成苗率。

表4 谷子品種、2,4-D濃度及干燥處理時(shí)間對(duì)谷子成熟胚離體再生的影響Table 4 Effects of different millet varieties, 2,4-D and desiccation on callus induction and differentiation of >mature millet embryos

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化方案：晉谷21的成熟胚在2,4-D濃度為9 μmol·L-1、干燥時(shí)間為4 h的條件下，離體再生效率較高，分化率為61.63%，成苗率為27.78%。按照該實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了3組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，分化率均值為64.35%，成苗率均值為29.06%。由此證明了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的離體再生培養(yǎng)體系基本穩(wěn)定可靠，可重復(fù)性強(qiáng)，該培養(yǎng)體系可以用于后期遺傳轉(zhuǎn)化等工作。

3 討論

基因型是影響建立谷子離體再生體系的重要因素，不同品種谷子的愈傷誘導(dǎo)率不同，分化率差異明顯，篩選高效的受體基因型仍是谷子組培工作的重點(diǎn)。Satish等[22]選用“CO5、CO7、TNAU43、RS118”等不同谷子品種研究其在不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、頭孢、精氨酸等添加物下成熟胚再生能力，表明了不同基因型谷子再生能力差異比較大，愈傷的誘導(dǎo)和分化力不同，并篩選出高效基因型“CO5”。本研究選用晉谷21、長(zhǎng)農(nóng)35、長(zhǎng)生06、長(zhǎng)生07、長(zhǎng)生13、晉谷4號(hào)等6種基因型的谷子，結(jié)果表明這6種基因型谷子愈傷組織的分化率差異顯著，這與袁進(jìn)成等[23]、Lata和Gupta[24]對(duì)谷子成熟胚愈傷誘導(dǎo)研究的結(jié)論一致，在谷子離體培養(yǎng)中，愈傷組織誘導(dǎo)及分化在不同基因型間差異較大。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。生長(zhǎng)素被認(rèn)為是植物組織培養(yǎng)過程中影響細(xì)胞分裂、形態(tài)分化和再生的最重要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。Lakkakula等[25-26]在MS培養(yǎng)基中分別添加毒莠定(picloram)、2,4-D和2,4,5三氯苯氧基乙酸(2,4,5-trichlorophenoxy，2,4,5-T)3種不同濃度的生長(zhǎng)素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入3.5 mg·L-1(15.8 μmol·L-1)2,4-D能夠明顯提高谷子愈傷組織誘導(dǎo)率。Satish等[7]通過在MS培養(yǎng)基上加入18 μmol·L-12,4-D，評(píng)估8個(gè)基因型的龍爪稷，從而建立高效的離體再生體系。谷子愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入2,4-D在其他研究中也得到類似結(jié)果[13,27]。在谷子成熟胚離體再生的過程中，不同濃度2,4-D對(duì)其誘導(dǎo)及分化的影響極為顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，晉谷21、長(zhǎng)生35、長(zhǎng)生06在2,4-D濃度為9 μmol·L-1時(shí)能提高分化率和成苗率；2,4-D濃度提高時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)受抑制，分化率下降，這與王曉璐等[28]的研究結(jié)果一致。

研究表明，適度干燥處理愈傷組織可使細(xì)胞失水，提高愈傷組織的分化率，并能降低愈傷組織分化過程中污染的可能性，促進(jìn)植株再生[29]。Masayoshi等[30]將水稻愈傷組織在分化前進(jìn)行24 h干燥處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生頻率提高到47%，而未處理組再生頻率低于5%。張?jiān)虑俚萚31]將3個(gè)品種的小麥成熟胚愈傷組織干燥處理8～12 h，發(fā)現(xiàn)“小偃22”愈傷組織的分化率達(dá)到最高，為41.2%。而本研究結(jié)果表明，待分化的愈傷組織干燥處理4 h分化率達(dá)到峰值，8 h干燥處理的分化率明顯下降，對(duì)谷子成熟胚愈傷組織進(jìn)行4 h干燥處理的效果較好。

基因型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D及干燥處理是影響谷子離體再生體系建立的三個(gè)重要因素，以往的研究多數(shù)是對(duì)這3個(gè)因素水平進(jìn)行單因素分析，未考慮到它們之間的相互影響，本研究利用正交實(shí)驗(yàn)的方法選出這三個(gè)因素的最優(yōu)組合，結(jié)果顯示晉谷21在2,4-D濃度為9 μmol·L-1、4 h干燥處理?xiàng)l件下所建立的再生體系最好。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在此條件下，分化率為64.35%，成苗率為29.06%，表明該組合建立的谷子成熟胚離體再生體系穩(wěn)定可靠，可重復(fù)性強(qiáng)。但也可以看出，谷子成熟胚離體再生過程中，分化生根較容易，但在生根培養(yǎng)基上的根系較纖細(xì)且生根時(shí)間不一致，移栽時(shí)根容易折斷，不利于移栽，成苗率不夠理想。后續(xù)研究可以通過添加特定的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子改善生根情況，從而提高成苗率。本研究結(jié)果為谷子高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)，為利用基因工程手段進(jìn)行谷子品質(zhì)改良提供了依據(jù)。