李芳芳, 穆登彩, 楊春艷, 王磊, 沈昊, 鄭尚永

云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 昆明 650091

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年新增病例超過(guò)1 400萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)800萬(wàn)[1]。肺癌的發(fā)病率正在逐年增加[2]。在中國(guó)，肺癌仍然是最常見(jiàn)的癌癥,且居癌癥死亡率之首[3]，其中空氣污染是狀況惡化的首要原因[4]。通過(guò)科研及醫(yī)務(wù)人員在癌癥治療方面的努力，如開(kāi)發(fā)新的治療方法、發(fā)現(xiàn)新的生物治療靶點(diǎn)，使得在過(guò)去的幾十年中早期肺癌患者生存率大幅提高，且各個(gè)治療階段瓶頸都有所突破[5-6]。然而，如后期肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果就會(huì)十分不佳[6]。因此，早期診斷和新的治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)仍然至關(guān)重要。

人類驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員26B(KIF26B)是一個(gè)由2 108個(gè)氨基酸組成[7]，編碼驅(qū)動(dòng)蛋白家族的成員。在胚胎發(fā)生的小鼠模型中KIF26B基因特別參與肢體、面部和體節(jié)的發(fā)育[8]。在胚胎腎臟發(fā)育中，KIF26B在調(diào)節(jié)與輸尿管芽接觸的間充質(zhì)細(xì)胞的粘附中起關(guān)鍵作用[8]。KIF26B的過(guò)表達(dá)已經(jīng)被證明能夠促進(jìn)N-鈣黏蛋白和MHCⅡ類分子之間的相互作用，從而增加細(xì)胞黏附力[9-10]。最近研究還發(fā)現(xiàn)KIF26B基因有助于腫瘤發(fā)生，并賦予某些癌癥惡性行為。在胃癌[11]和結(jié)直腸癌[12]中過(guò)表達(dá)KIF26B與腫瘤大小、腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)[11]。同時(shí)過(guò)表達(dá)KIF26B基因也能增加骨肉瘤的化療耐藥性[13]。與此同時(shí)，驅(qū)動(dòng)蛋白超家族蛋白(KIFs)是與微管結(jié)合且與ATP酶活性相關(guān)的分子運(yùn)動(dòng)蛋白[14]，它與癌癥發(fā)展的機(jī)制相關(guān)。先前的報(bào)道表明，KIF家族中的KIF1B與肺癌的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后有關(guān)，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和肝細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。KIF11在前列腺細(xì)胞核中的表達(dá)狀況作為治療前列腺癌的生物標(biāo)記分子[17]。 KIF2A和KIF14的表達(dá)水平與乳腺癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，在乳腺癌細(xì)胞系中敲低KIF3C能夠抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和轉(zhuǎn)移[18-20]。此外，KIF3C通過(guò)敲低誘導(dǎo)G2/M期阻滯降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖[21-22]。KIF18A通過(guò)修復(fù)Akt分子的磷酸化參與結(jié)直腸癌的發(fā)展[23]。最近的研究表明,KIF26B與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性有關(guān)[13]，KIF26B的高表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤生長(zhǎng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體抑制和預(yù)后不良呈正相關(guān)[10]。在喉腺癌中，KIF26B基因的拷貝數(shù)與結(jié)直腸腺瘤的易感性明顯相關(guān)[24]。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)KIF26B在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其下調(diào)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。Zhang等[26]研究表明KIF26B可作為癌基因發(fā)揮作用，激活VEGF途徑可促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移。而KIF26B的下調(diào)抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[27]。基于此，推測(cè)KIF26B與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，并且通過(guò)EMT影響相關(guān)通路蛋白的表達(dá)。

本研究旨在確定KIF26B在NSCLC中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制，我們首先檢測(cè)KIF26B在NSCLC組織中的表達(dá)，然后研究KIF26B在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、周期和凋亡中的作用和機(jī)制，以及EMT通路蛋白的表達(dá)變化，以期探究KIF26B在肺小細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用正常對(duì)照組細(xì)胞BEAS-2B與NSCLC細(xì)胞株A549、NCI-H292，均購(gòu)自昆明動(dòng)物所細(xì)胞中心；Matrigel 基質(zhì)膠、Transwell 小室購(gòu)于 BD 公司;轉(zhuǎn)染試劑siRNA和siNC購(gòu)于GenePharma 公司；Lipofectamine RNAiMAX 購(gòu)于Invitrogen 公司；Opti-MEM購(gòu)于Gibco 公司；Primer,1640培養(yǎng)基購(gòu)于上海 Sangon Biotech 公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 NO:KGA512購(gòu)于江蘇凱基生物公司；細(xì)胞凋亡試劑Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購(gòu)于南京諾維贊生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)細(xì)胞株 BEAS-2B、A549、NCI-H292細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在 5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析

用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIF26B在NSCLC與正常組織的表達(dá)差異，進(jìn)行正常與癌癥成對(duì)的KIF26B mRNA表達(dá)量的差異分析，用Prism繪制表達(dá)量差異圖譜。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 敲低內(nèi)源性KIF26B基因及siRNA轉(zhuǎn)染NCI-H292和A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 選用肺癌細(xì)胞株 A549和 H292 (購(gòu)于昆明動(dòng)物所)，置于含10%胎牛血清 (美國(guó)Gibico公司)1640培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)，37 ℃、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為 2 組：敲減對(duì)照組(Si-NC)和KIF26B敲減組(Si-KIF26B)。轉(zhuǎn)染 KIF26B SiRNA將肺癌細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80% 融合后，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用 Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen 公司)、Opti-MEN試劑(Gibco 公司)按照比例配置。分別轉(zhuǎn)染 SiRNA至 NCI-H292細(xì)胞和 A549細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后棄上清，收集細(xì)胞，qPCR法檢測(cè)敲低效率。

利用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取轉(zhuǎn)染前后肺癌細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TaKaRa公司)將 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用 SYBRGREEN PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)對(duì) KIF26B和內(nèi)參基因進(jìn)行PCR，引物序列如表1所示。

表1 本研究所涉及的引物序列Table 1 All primer sequences used in this research

注：PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

計(jì)算細(xì)胞的2-ΔΔCt值和RQ值，根據(jù)后者計(jì)算KIF26B的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算時(shí)取其平均值。

1.4.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn) ①CCK8檢測(cè)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。具體如下：檢測(cè)前每孔加入100 mL CCK8試劑，孵育4 h，震蕩混勻， 酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)時(shí)間梯度分別為0、24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

②實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(RTCA)檢測(cè)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H292和A549細(xì)胞，用胰酶消化計(jì)數(shù)后加入到E-Plate 16-well板，每孔3 000個(gè)·90 μL-1，每種處理均重復(fù)2個(gè)，每塊板接種兩個(gè)細(xì)胞系，加好細(xì)胞懸液后將 E-Plate 16-well 板放回RTCA 儀器，檢測(cè)24 h后將E-Plate 16-well板拿出，每孔加轉(zhuǎn)染混合體系10 μL，最后放回儀器檢測(cè)72 h。

1.4.3 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染KIF26B SiRNA和肺癌細(xì)胞胰酶消化、無(wú)血清培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5×105個(gè)細(xì)胞。

①實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(RTCA)檢測(cè)。在CIM-Plate 16-wel板的下室加入 165 μL 20% FBS培養(yǎng)基，上室侵襲一側(cè)加入10 μL的基質(zhì)膠放置2 h待其固定，之后吸出基質(zhì)膠加入90 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基于上室后測(cè)基線，然后吸盡培養(yǎng)基繼續(xù)在上室中每90 μL細(xì)胞懸液加入1×104個(gè)細(xì)胞，最后再放入機(jī)器檢測(cè)48 h。

②Transwel檢測(cè)。取Transwell小室，分別在24孔板上室中加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基和含基質(zhì)膠的無(wú)血清培養(yǎng)基，目的在于先潤(rùn)濕濾膜，潤(rùn)濕后吸盡培養(yǎng)基加細(xì)胞懸液，每孔加入3×104個(gè)細(xì)胞和200 μL細(xì)胞懸液，下室加入 800 mL 20% FBS 1640培養(yǎng)基，接著放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。2 d后取出小室固定(1 mL 4%多聚甲醛常溫固定 60 min)、染色(1 mL 0.25%結(jié)晶紫染液染色 60 min)、觀察。

1.4.4 細(xì)胞周期、凋亡實(shí)驗(yàn) 使用BD FACS Jazz flow cytometer 流式細(xì)胞分選儀檢測(cè)細(xì)胞周期倍體的分布、檢測(cè)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。NCI-H292和A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siKIF26B培養(yǎng)48 h。①對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞的周期：首先，用胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清，PBS清洗計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；其次，固定細(xì)胞：加1 mL -20 ℃預(yù)冷的70%乙醇(PBS 稀釋配制)輕吹重懸細(xì)胞，后放于4 ℃冰箱靜置，固定過(guò)夜，第二天離心，PBS清洗后加500 μL 染色液(PI∶RNase=9∶1)，室溫避光染色 60 min即可上機(jī)器檢測(cè)。②細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：依舊用胰酶消化細(xì)胞，離心，PBS清洗后計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。特別注意：此處用的胰酶不含 EDTA，因?yàn)锳nnexin V-FITC是依賴鈣離子的，而EDTA是鈣離子螯合劑，所以采用不含EDTA的胰酶用于凋亡實(shí)驗(yàn)。清洗離心后，每管分別加入 5 μL PI、5 μL Annexin V-FITC、100 μL Binding Buffer輕吹混勻，然后室溫避光染色10 min，最后再加400 μL Binding Buffer輕吹混勻后上機(jī)器檢測(cè)(細(xì)胞周期和凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用Flowjo 軟件進(jìn)行分析)。

1.4.5 蛋白印跡 將轉(zhuǎn)染了72 h的NCI-H292和A549細(xì)胞用胰酶消化后加入現(xiàn)配制的蛋白裂解液(100 μL lysis+4 μL PI+10 μL PPI)，反復(fù)吹打混勻后置于冰上裂解 30 min；4 ℃，14 000 r·min-1離心10 min，吸取上層液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷1.5 mL離心管內(nèi)，做好標(biāo)記，-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白濃度，體系如表2所示。加入2 μL待測(cè)樣本，18 μL ddH2O，200 μL BCA 工作液，置入 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中顯色反應(yīng)30 min，取出反應(yīng)板，5 min 之內(nèi)使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為 562 nm 處的光密度值。然后進(jìn)行電泳，封閉，一抗孵育至過(guò)夜，曝光。

表2 BCA法測(cè)定蛋白濃度的體系Table 2 System of protein concentration determination by BCA

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0軟件，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)驗(yàn)證。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIF26B在NSCLC的mRNA表達(dá)水平

從 TCGA(the Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)下載的關(guān)于KIF26B的NSCLC患者的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)，經(jīng)分析選取了兩組信息，第一組樣本是：226 例NSCLC 樣本和20例正常對(duì)照樣本(圖1A)，第二組樣本是：58例正常樣本與癌癥成對(duì)樣本(圖1B)，GraphPad Prism 5.0軟件經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，KIF26B基因的 mRNA 表達(dá)水平在 NSCLC 癌組織中是顯著上調(diào)的。

2.2 敲低內(nèi)源性KIF26B對(duì)KIF26B的mRNA表達(dá)水平的影響

選取NCI-H292和A549兩個(gè)細(xì)胞系，驗(yàn)證KIF26B的siRNA的轉(zhuǎn)染效率，由 RT-PCR 結(jié)果(圖2)顯示，siKIF26B能顯著敲低 NCI-H292和A549細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)，敲低KIF26B后抑制NSCLC的KIF26B mRNA表達(dá)。

2.3 敲低內(nèi)源性KIF26B對(duì)NSCLC增殖能力的影響

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是其治愈率低的重要原因之一。為了進(jìn)一步研究KIF26B的功能，我們探究敲低內(nèi)源性KIF26B后是否能抑制NSCLC的惡性增殖。通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)以及實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(RTCA)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。CCK8結(jié)果顯示(圖3)，轉(zhuǎn)染siRNA敲低了KIF26B 基因后，轉(zhuǎn)染的siKIF26B A549細(xì)胞株在24 h后與siNC相比增殖有顯著的下降趨勢(shì)。而轉(zhuǎn)染的siKIF26B NCI-H292細(xì)胞株則在48 h后增殖明顯下降。RTCA結(jié)果表明(圖3)，敲低KIF26B基因表達(dá)能顯著抑制 NSCLC 細(xì)胞系(NCI-H292和A549細(xì)胞)的增殖。RTCA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染的siKIF26B A549及NCI-H292細(xì)胞株在35 h與siNC相比增殖有顯著地下降趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明敲低內(nèi)源性KIF26B后能夠抑制NSCLC的惡性增殖。

A: 20例正常和226例NSCLC中KIF26B mRNA的表達(dá)水平；B: 58例正常和58例NSCLC成對(duì)樣本KIF26B mRNA的表達(dá)水平。***表示數(shù)據(jù)在P<0.001水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIF26B mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of KIF26B mRNA in NSCLC tissues from TCGA database

注：Si-NC—對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；Si-KIF26B—NSCLC中KIF26B的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。*** 表示數(shù)據(jù)與對(duì)照相比在P<0.001水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2 敲低KIF26B后KIF26B mRNA的表達(dá)變化Fig.2 The expression of KIF26B mRNA after knockdown of KIF26B

注：**表示數(shù)據(jù)在P<0.001水平上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3 敲低KIF26B對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of KIF26B knockdown on the proliferation of non-small cell lung cancer cells

2.4 敲低內(nèi)源性KIF26B對(duì)NSCLC的遷移、侵襲能力的影響

檢測(cè)siRNA 敲低KIF26B的表達(dá)后非小細(xì)胞肺癌的遷移、侵襲能力是否有變化。Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力，與對(duì)照組相比NCI-H292與A549的遷移、侵襲能力明顯受到抑制(圖4、5)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001 )。隨后又采用RTCA 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法，從實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀監(jiān)測(cè)的曲線圖顯示(圖4)，在NCI-H292和A549細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的曲線相比于轉(zhuǎn)染了 siNC 的對(duì)照組遷移、侵襲能力有明顯的下降趨勢(shì)。

2.5 敲低內(nèi)源性KIF26B對(duì)NSCLC的細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

實(shí)驗(yàn)中用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的周期進(jìn)行分析，檢測(cè)敲低KIF26B基因表達(dá)后，在NCI-H292和A549細(xì)胞中，各細(xì)胞周期DNA 倍體含量的變化。由于細(xì)胞中，DNA合成前期(G1 期)與DNA合成后期(G2期)中，DNA的含量具有兩倍關(guān)系，因此流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果用 Flowjo 軟件圈門時(shí)，著重顯示二倍關(guān)系(如圖6所示，圖中兩個(gè)峰的橫坐標(biāo)近似為二倍關(guān)系)，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，在NCI-H292、A549細(xì)胞系中，G0/G1 期向 S 期的轉(zhuǎn)化受到抑制，細(xì)胞周期分布圖的第一個(gè)峰顯著上升(圖6A)，柱狀圖表現(xiàn)為G0/G1期阻滯，即G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著多于其他時(shí)期(圖5B)。結(jié)果說(shuō)明，若要抑制細(xì)胞的惡性增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期也是一個(gè)重要途徑。

注：在對(duì)照siRNA(NC)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和siKIF26B轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上進(jìn)行遷移能力分析，將細(xì)胞處理72 h。 A：Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn); B： RTCA 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析遷移實(shí)驗(yàn)。*** 表示與Si-NC相比差異在P<0.001水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 敲低KIF26B對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移能力的影響Fig.4 Effect of KIF26B knockdown on the migration of non-small cell lung cancer cells

2.6 敲低內(nèi)源性KIF26B對(duì)NSCLC凋亡的影響

由于KIF26B是肌動(dòng)蛋白家族成員，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均起重要作用。前面的實(shí)驗(yàn)表明，KIF26B對(duì)NSCLC具有促進(jìn)惡性增殖以及促進(jìn)其遷移和侵襲的能力，因此推測(cè)敲低KIF26B對(duì)癌細(xì)胞的凋亡可能有促進(jìn)作用。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢查，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果用 Flowjo 軟件制圖。如圖7所示，敲低內(nèi)源性KIF26B的A549細(xì)胞系凋亡占比為15%，而對(duì)照組僅為8.5%，敲低內(nèi)源性KIF26B的NCI-H292細(xì)胞系凋亡占比為10.8%，而對(duì)照組為7%。由此可知，敲低內(nèi)源性KIF26B能顯著促進(jìn)NSCLC凋亡。

2.7 敲低 KIF26B 基因表達(dá)對(duì)通路蛋白分子水平變化的影響

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低 KIF26B 基因表達(dá) A549 和 NCI-H292 細(xì)胞增殖明顯受阻、細(xì)胞 G0/G1 期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)通路蛋白分子表達(dá)水平(圖8)。主要檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白 Cyclin-D1、細(xì)胞凋亡通路蛋白 Caspase 3、PARP1、Bcl-2,與細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的N-cadherin 和Vimentin 的蛋白分子表達(dá)水平。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)敲低KIF26B 基因表達(dá)后，細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D1 顯著下調(diào)，終末剪切酶Caspase 3激活，其剪切底物 PARP1 被剪切，Cleaved PARP1 顯著上調(diào)，抑凋亡蛋白 Bcl-2 顯著下調(diào)，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物 N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)下調(diào)。蛋白分子表達(dá)水平與相關(guān)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，由結(jié)果可知，敲低 KIF26B 基因表達(dá)通過(guò)調(diào)控 Caspase-3/PARP1 信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡、通過(guò)調(diào)控 EMT 通路蛋白 N-cadherin 和 Vimentin 表達(dá)水平抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

注：在對(duì)照siRNA(NC)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和siKIF26B轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上進(jìn)行侵襲能力分析，將細(xì)胞處理72 h。A:Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)；B:RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析侵襲實(shí)驗(yàn)。*** 表示與Si-NC相比差異在P<0.001水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 敲低KIF26B對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲能力的影響Fig.5 Effect of KIF26B knockdown on the invasiveness of non-small cell lung cancer cells

3 討論

NSCLC的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及基因表達(dá)、信號(hào)通路和表觀遺傳學(xué)的變化。核心基因的異常表達(dá)常常導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和遷移失調(diào)[28-29]。因此，研究異常表達(dá)的核心基因?qū)﹂_(kāi)發(fā)NSCLC治療新靶點(diǎn)具有重要意義。NSCLC早期診斷率低和術(shù)后復(fù)發(fā)是影響NSCLC患者預(yù)后的兩大因素[30]。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)肝癌的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。

然而，KIF26B在NSCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚不清楚。我們進(jìn)行了一項(xiàng)深入的研究，以闡明KIF26B在NSCLC進(jìn)展中的功能意義。首先，我們檢測(cè)了NSCLC組織和癌旁正常組織中KIF26B的mRNA水平，并觀察到KIF26B在癌組織中高表達(dá)且與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)一致。提示KIF26B在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起著重要的生物學(xué)作用。為了更好地了解KIF26B誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的潛在機(jī)制，我們?cè)贙IF26B敲除后進(jìn)行細(xì)胞周期分布實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)KIF26B的敲除阻滯了G1-S期轉(zhuǎn)變，而調(diào)控 G0/G1 期向 S 期轉(zhuǎn)化的細(xì)胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)顯著下調(diào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào) KIF26B 調(diào)控 Cyclin D1 阻礙了細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制了 NSCLC 細(xì)胞的增殖。Cyclin D1 的表達(dá)在包括 NSCLC 的多種人類癌癥中經(jīng)常被促進(jìn)[31]，且Cyclin D1 蛋白的過(guò)度表達(dá)在 NSCLC 的發(fā)生和細(xì)胞增殖中起著重要作用[32]。這為本文的研究結(jié)果提供了有利證據(jù)，提示 KIF26B 高表達(dá)可能與 NSCLC 細(xì)胞增殖呈正相關(guān)。

注：轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)An-nexin V/PI染色和流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量。 敲低KIF26B基因可以顯著阻斷NCI-H292和A549細(xì)胞在不同階段的轉(zhuǎn)化。A：細(xì)胞周期分布；B：細(xì)胞周期分布直方圖?！?, **, ***”分別表示同組數(shù)據(jù)的差異在P<0.05, P<0.01, P<0.001水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6 敲低KIF26B對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.6 The effect of knocking down KIF26B on cell cycle

KIF26B的表達(dá)水平與NSCLC的生長(zhǎng)有關(guān)，提示了KIF26B可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究所得結(jié)果和結(jié)直腸癌、胃癌以及乳腺癌所得結(jié)論一樣，即敲低KIF26B會(huì)降低NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力[8,26,33]。結(jié)果顯示，敲低KIF26B會(huì)降低癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，且參與調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 的 N-cadherin 和 Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。有研究表明N-cadherin的高表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)、遷移、侵襲、淋巴轉(zhuǎn)移和EMT呈正相關(guān)[34]。Vimentin是維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重要蛋白，主要表達(dá)在間充質(zhì)細(xì)胞和一些外胚層細(xì)胞，與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。有研究證實(shí)，上皮來(lái)源腫瘤中出現(xiàn)Vimentin的高表達(dá)與腫瘤遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[35]。因此，N-cadherin和Vimentin的高表達(dá)均可提示腫瘤發(fā)生EMT，而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。在對(duì)KIF26B 基因功能研究中發(fā)現(xiàn)，該基因與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。那么，KIF26B也可能通過(guò)調(diào)控 N-cadherin 和 Vimentin 參與 NSCLC 細(xì)胞 EMT 過(guò)程。

注：將細(xì)胞分為四組：對(duì)照，單PI染色，單AN染色，PI、AN雙染色，細(xì)胞處理72 h。A: 凋亡分布; B: 凋亡直方圖，“*, **, ***”分別表示同組數(shù)據(jù)的差異在P<0.05, P<0.01, P<0.001水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖7 敲低KIF26B對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 The effect of knocking down KIF26B on apoptosis

圖8 敲低KIF26B對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 The effect of knocking down KIF26B on >protein expression

聚ADP核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1, PARP-1],是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中具有重要生理功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，其主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在DNA的損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖分化調(diào)控、細(xì)胞凋亡及基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用[36]。Caspase-3是Caspases家族中重要的成員之一,大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終均需通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Hay 等[20]研究表明，重組蛋白 IAP 可以下調(diào) Caspase-3 或 Caspase-7 的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡。PARP-1 是 Caspase-3 下游的信號(hào)分子，在大量自由基和氧化劑存在的情況下會(huì)引發(fā) PARP-1過(guò)度激活，引起 ATP 的過(guò)度消耗，引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示敲低KIF26B使得Caspase 3 激活，其剪切底物 PARP1 被剪切，Cleaved PARP1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用的 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KIF26B 的下調(diào)激活 Caspase-3/PARP1 信號(hào)通路，促進(jìn) NSCLC 細(xì)胞凋亡。

總之，本研究結(jié)果有助于理解NSCLC進(jìn)展的分子機(jī)制，并可能有助于開(kāi)發(fā)更好的治療NSCLC的靶點(diǎn)。但是KIF26B與其基因的互作以及它與其他相關(guān)通路的互作尚不清楚，還需進(jìn)一步研究,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)NSCLC靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)打下了研究基礎(chǔ)。