張紅兵, 劉薈, 史秀英, 李會宣, 范道春

河北經貿大學生物科學與工程學院, 石家莊 050061

21世紀，隨著工業(yè)化生產迅猛發(fā)展，人類對化石能源的消耗有增無減，據(jù)報道，全球約80% 能源消耗來自化石燃料[1]。然而化石能源的不可再生性導致其儲存量日趨下降，同時使用中產生的污染，嚴重威脅著環(huán)境和人類健康。我國人口眾多，是世界第二大能源消費國，研發(fā)可再生清潔能源取代化石燃料迫在眉睫[2,3]。

生物燃料的開發(fā)近年來如火如荼，有望成為石油能源的替代品[4]，而微藻作為第三代、第四代生物能源有著巨大優(yōu)勢[5]，微藻分為原核藻類和真核藻類，多為單細胞生長，易于培養(yǎng)、生長迅速、環(huán)境友好，可進行光合作用[6]，含油量高，部分微藻油脂可達到50%～90%，占地少，較農作物類油脂、動物油脂培養(yǎng)周期短，部分微藻可在海水、鹽堿地、廢水等地大規(guī)模培養(yǎng)，減少耕地資源的浪費[7]。微藻富含蛋白質、脂質等多種代謝產物，具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、防止心血管疾病等生理保健功能。利用污水培養(yǎng)產油微藻并耦合生物質能源生產，既可治理水污染、又可緩解能源緊缺，有益于人類擺脫對化石資源的過度依賴[8-9]，然而，如何提高微藻的產油效率、降低微藻產業(yè)化生產成本等問題亟待解決[10]，因此篩選生長狀況良好且產油率高的微藻，是微藻產業(yè)化進程中的關鍵技術之一。

我國幅員遼闊，不同區(qū)域氣候條件差異較大，一方水土養(yǎng)一方“藻”，不同區(qū)域的藻類表現(xiàn)出的差異較大。石家莊位于華北平原腹地，四季分明、晝夜溫差較大，但夏季日照充足、氣溫高，常規(guī)實驗室的藻株并不能適應石家莊室外的培養(yǎng)條件，本試驗試圖從石家莊本地自然河流采集更加適應本地環(huán)境條件的藻種，在室外培養(yǎng)用于廢水處理，試驗采用富集培養(yǎng)并結合18S rDNA鑒定,篩選生長狀況良好、產油率高的微藻，然后利用響應曲面法(RSM)耦合Box-Behnken設計探索微藻最佳異養(yǎng)培養(yǎng)條件，為微藻的產業(yè)化生產奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

水樣分別取自于河北樂源牧業(yè)奶牛養(yǎng)殖場廢水、河北經貿大學人工湖水、正定縣護城河水以及石家莊滹沱河水。

1.2 藻種篩選

采用富集培養(yǎng)法對微藻進行篩選，用紗布(50目紗布，3次折疊)過濾水樣以去除大型固體雜質，取10 mL水樣加入90 mL BG11[11]培養(yǎng)液，放置于光照培養(yǎng)箱(GZX-400BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)內培養(yǎng)[溫度為(27±1)℃、光照強度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h]至15 d左右。待微藻生長至淺綠色時用接種環(huán)劃線到BG11固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(培養(yǎng)條件不變)至單菌落，選擇肥沃的單菌落接種到BG11液體培養(yǎng)基中，對微藻進行進一步擴大培養(yǎng)。抽取適量混合藻液，在顯微鏡下觀察微藻細胞形態(tài)，選取形態(tài)不同的藻種繼續(xù)擴大培養(yǎng)3次，供后續(xù)試驗使用。

1.3 分析方法

藻細胞密度生長曲線的測定：測定微藻培養(yǎng)時間與藻細胞密度生長的關系，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微藻[溫度為(27±1)℃、光照強度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h],每天定時取樣，采用紫外分光光度計(UV-2500型，上海元析儀器有限公司)測定微藻680 nm處的吸光度值，實驗重復3次取平均值，記錄數(shù)據(jù)。

生物量的測定：在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)微藻[溫度為(27±1)℃、光照強度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h]，待微藻生長至穩(wěn)定期，將離心管在90℃烘箱中烘干至恒重(M0)，取混合均勻的微藻液30 mL置于上述烘干的離心管內，離心5 min(4 000 r·min-1，4 ℃)，倒掉上清液，保留離心管底部離心產物，并用蒸餾水3次洗滌離心產物，以上離心操作步驟重復3次，隨后將離心產物放入冰箱內冷凍(-20℃，2 h)，最后將離心產物在干燥箱中烘干(50℃)至重量恒重M1。以上操作步驟實驗重復3次，按如下公式計算生物量。

用冷凍干燥法測量藻細胞的油脂含量[12-13]。油脂含量按照以下公式計算得出。

最后計算油脂的產油率，油脂產率的計算公式如下。

式中,m為培養(yǎng)末期藻體生物量，m0為初始藻體生物量，n為培養(yǎng)末期藻體的油脂含量，n0為初始藻體油脂含量，t為培養(yǎng)時間，x為油脂產率。

用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)分析，并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進一步分析10株微藻生物量之間的差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義[14]。

1.4 藻種鑒定

形態(tài)學鑒定：篩選的10株藻種經分離純化后，用顯微鏡進行形態(tài)觀察。

對微藻進行分子生物學鑒定：采用試劑盒(OMEGA BIO-TEKDNA，安諾倫生物科技有限公司)提取微藻基因組DNA，進行PCR擴增，引物序列為：18S rDNA-F：5′-CAAGTTTCTGCCCTATCGCT-3′；18S rDNA-R：5′-GCTTTCGCAGTAGTTCGTCTT-3′。PCR程序為： 94℃, 5 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 60 s，35個循環(huán)； 72℃, 7 min。瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物，切下目的條帶，將其用OMEGA BIO-TEK回收試劑盒回收，進行測序(賽默飛世爾科技公司)，在GenBank數(shù)據(jù)庫中，進行Blast序列比對，采用MEGA 7.0.14軟件進行多重序列分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

第六，加強腸道的調理。養(yǎng)雞就是養(yǎng)腸道，腸道的健康程度決定了雞群的營養(yǎng)吸收能力和抗病水平的高低，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定關系重大，根據(jù)雞群的腸道狀況，適當?shù)奶砑游⑸鷳B(tài)制劑，用以調節(jié)腸道菌群平衡，提高飼料的消化利用率，減少腸道有害菌的數(shù)量，進而達到降低料肉比和料蛋比，減少腸道疾病，提高經濟效益的目的。

1.5 異養(yǎng)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素基礎試驗，選擇調控微藻培養(yǎng)基中碳源、磷源和鎂源濃度成分，其中以葡萄糖作為碳源設置3個濃度梯度分別為15、20、25 g·L-1。以K2HPO4·3H2O作為磷源分別為60、90、120 mg·L-1。以MgSO4·7H2O為鎂源設置3個濃度梯度分別為160、200、240 mg·L-1。按照Design-Expert(V8.0.6.1)軟件耦合BBD設計三因素三水平實驗(表1)，按照BBD中成分組合將這3種成分添加到含225 mL培養(yǎng)基錐形瓶中培養(yǎng)(表2)，共計17組試驗，基礎培養(yǎng)基為不添加碳源、磷源和鎂源的BG11液體，放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[溫度為(27±1)℃、光照強度8 000 lx、光暗比24 h∶0 h],每天搖瓶培養(yǎng)3次，定時取樣測定生物量，采用RSM對培養(yǎng)結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 10株微藻篩選結果

由表3所示，本次試驗共從4個取樣點取樣，每處取樣點在不同區(qū)域取樣3次，每次取樣500 mL·瓶-1，每次取樣2瓶，共計24個樣品，對樣品進行富集培養(yǎng)后共篩選出10株藻株，形態(tài)多為圓形藻。護城河篩選的藻株最多，護城河篩選出4株藻，養(yǎng)殖廢水中篩選出2株藻，滹沱河篩選出2株藻，河北經貿大學人工湖篩選出2株藻。

表1 響應曲面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 響應曲面試驗表Table 2 Response surface test table

表3 10株微藻細胞形態(tài)Table 3 Morphology of 10 microalgae strains

圖1 部分微藻照片F(xiàn)ig.1 Pictures of part microalga

圖1為部分微藻的顯微鏡照片，藻體呈綠色，單個微藻細胞長度均在50 μm以內，有單生、對生、叢生藻細胞，形狀有球狀、紡錘狀、針形，藻種DK-1、DK-9肉眼可見鞭毛，藻種的鞭毛可用來繁殖或運動，其中，除藻種DK-9、DK-10不易沉降，其他藻種均易沉降，易沉降的微藻可降低采收成本，同一采樣區(qū)域可篩選出不同藻種。

2.2 微藻生長曲線(microalgae growth curve)

如圖2所示為10株藻的細胞生長密度曲線圖，不同藻屬的藻細胞生長狀況不同，1～9 d時10株微藻進入指數(shù)生長期，細胞密度值呈指數(shù)快速增長，9 d后進入穩(wěn)定期，細胞密度增長緩慢，故選擇在第10 d收獲微藻，其中DK-3、DK-7的差異優(yōu)勢較為明顯，細胞密度曲線一直處于其他藻株的上方。

2.3 微藻理化指標的比較

如圖3所示，10株微藻的生物量、油脂含量、單位體積生物量產率和油脂產率均有差異，這是由于不同藻株的生理生化特性有差異。其中藻株DK-3是滹沱河中篩選出的藻，生物量(1.86 g·L-1)、總脂含量(14.27%)、單位體積生物量產率(14.27%)、油脂產率(10.23 mg·L-1·d-1)四項指標均為10株微藻中最高，比最低微藻DK-10的生物量(0.67 g·L-1)高出177.6% ，比總脂含量最低DK-8的5.81%高出145.6%。因此藻株DK-3具有較高的研究潛能，而從滹沱河篩選的另一株藻DK-6生物量和總脂含量并未表現(xiàn)出優(yōu)勢，說明從同一區(qū)域篩選出的藻的生理指標有所差異。從護城河篩選出的藻DK-7四項指標也表現(xiàn)出優(yōu)勢，生物量為1.43 g·L-1，總脂含量為10.96%，僅次于藻株DK-3。從養(yǎng)殖廢水中篩選出的藻株DK-8，生物量為1.15 g·L-1,但其總脂含量為5.81%。研究價值較低，結合圖2中的細胞密度，生長后期藻種細胞密度表現(xiàn)的優(yōu)勢趨勢與生物量優(yōu)勢趨勢并不相同，如藻株DK-3的細胞密度曲線在10株藻中并不占優(yōu)勢，但其生物量生長優(yōu)勢趨勢明顯。分析原因是由于藻種不同所導致的，不同藻種生長時結團率不同，結團率影響細胞密度的測量。如圖3所示，10株微藻的四項基本指標，使用SPASS 19.0軟件對10株微藻的油脂產率進行方差分析，并通過LSD多重比較得出，微藻DK-3的油脂產率較高(P<0.05)。因此，微藻DK-3具有較好的產油脂能力，故選微藻DK-3作為后續(xù)研究對象。

圖2 10株微藻的生長曲線 (n=3)Fig.2 Growth curves of 10 microalgae strains (n=3)

圖3 10株微藻的生物量、總脂含量、單位體積生物量產率和油脂產率的比較Fig.3 Comparison of biomass, total lipid content, biomass yield per unit volume, and oil yield rate of >10 microalgae strains

2.4 藻種鑒定結果

提取藻種DK-3總基因組DNA，用特異性引物PCR擴增出目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳檢驗結果如圖4，圖中左側條帶為Maker，右側為目標產物條帶，將切下的目的條帶用OMEGA BIO-TEK回收試劑盒回收后測序，得到測序結果為707 bp。

如圖5所示，將所得序列，提交GenBank中進行Blast序列比對分析，然后利用MEGA7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，藻種DK-3與柵藻(ScenedesmusmeyenJQ315792.1)的18S rDNA具有較高的相似性，兩者同源性高達99.37%，結合藻種DK-3的形態(tài)學分析，藻種DK-3隸屬于柵藻屬，初步鑒定為柵藻(Scenedesmusmeyen)。

2.5 藻種DK-3異養(yǎng)培養(yǎng)優(yōu)化結果

采用BBD設計3種培養(yǎng)基不同成分組合，共計17組試驗組合，通過RSM對實驗結果建立模型，進行方差分析及顯著性檢驗(表4)。結果表明，回歸模型極顯著(P<0.00 1)，失擬不顯著，該模型的擬合系數(shù)(R2)為0.987 1，說明測量值與預測值具有較高的擬合度；校正決定系數(shù)(AdjR2)為0.970 4，表明有97.04%的響應值變化可用該模型來解釋，精密度(Adeq Precisior)為24.619>4.0，進一步說明該模型具有良好的擬合度，能夠對結果進行分析和預測，該模型具有統(tǒng)計學意義。

為了綜合考察葡萄糖，K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O成分含量及其交互作用對微藻DK-3生長的影響，采用 Design-Expert(V8.0.6.1)軟件輔助分析，3D 響應曲面結果如圖6所示。

圖4 藻種DK-3的18S rDNA序列PCR電泳結果Fig.4 PCR electrophoresis results of 18S rDNA >sequences of algae DK-3

圖5 藻種DK-3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of algae species DK-3

表4 響應面二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

注：“**”表示差異在P<0.01水平上有統(tǒng)計學意義；“*”表示差異在P<0.05水平上有統(tǒng)計學意義；“ - ”表示差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖6展示了以葡萄糖、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O三者含量交互作用對微藻生物量的影響，其中圖6A顯示當葡萄糖的濃度不變時，隨著MgSO4·7H2O含量的增加，微藻生物量值先升高后降低，當葡萄糖濃度為20.33 g·L-1，MgSO4·7H2O濃度為203.90 mg·L-1時，兩者交互作用最明顯，生物量值達到最大5.49 g·L-1。由方差分析結果可知，單因素葡萄糖濃度、MgSO4·7H2O濃度及其兩者交互作用對微藻生長量的影響均達到極顯著作用(P<0.01)。當葡萄糖濃度在17～23 g·L-1，MgSO4·7H2O濃度在184～220 mg·L-1時對微藻生物量的提高最有效。

圖6B展示了葡萄糖濃度、K2HPO4·3H2O濃度對微藻生物量影響的交互作用，顯示當葡萄糖濃度不變時，隨著K2HPO4·3H2O濃度的增加，微藻生物量總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在葡萄糖濃度為20.33 g·L-1、K2HPO4·3H2O濃度為92.58 mg·L-1時微藻生物量達到峰值5.49 g·L-1，隨著K2HPO4·3H2O含量繼續(xù)增加，微藻生物量逐漸減少，有方差分析結果可知，單因素K2HPO4·3H2O濃度(P<0.05)，顯著水平為0.003 7，但兩者的交互作用并未達到顯著水平。

圖6C展示了K2HPO4·3H2O的濃度水平和MgSO4·7H2O濃度水平對微藻生物量影響的交互作用，顯示K2HPO4·3H2O濃度與MgSO4·7H2O濃度交互作用并不明顯，同方差分析結果一致。

利用該軟件分析得到微藻優(yōu)化培養(yǎng)條件為：葡萄糖為20.33 g·L-1、K2HPO4·3H2O為92.58 mg·L-1、MgSO4·7H2O為203.90 mg·L-1。為了方便實際操作，將DK-3的異養(yǎng)培養(yǎng)最終條件確定為：葡萄糖為20 g·L-1、K2HPO4·3H2O為90 mg·L-1、MgSO4·7H2O為200 mg·L-1，經驗證在此培養(yǎng)條件下，微藻DK-3經240 h培養(yǎng)后，3組平行試驗平均生物量為5.47 g·L-1，與模型預測值相差不大，說明模型可行，油脂產量為1.28 g·L-1，比空白對照組藻種生物量3.37 g·L-1提高了62.31%。

A：葡萄糖與MgSO4·7H2O的交互作用；B：葡萄糖與K2HPO4·3H2O的交互作用；C：MgSO4·7H2O與K2HPO4·3H2O的交互作用。圖6 響應面法三維圖Fig.6 Three-dimensional diagram of response surface

3 討論

近幾年微藻在廢水處理方面的作用逐步引起注意，微藻可利用廢水中的化合物生長，如殘氮、殘磷，同時還可凈化水質，減少水體富營養(yǎng)化，微藻可處理的廢水種類很多，可處理奶牛場廢水、味精廠廢水、市政污水等，甚至有使用尿液培養(yǎng)微藻研究[15-17]。本研究從石家莊本地自然水體中采集并篩選微藻藻種，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，并用SPASS 19.0對數(shù)據(jù)結果進行方差分析，初步確定了一株產率油脂較高的微藻，并通過響應面分析確定了微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基成分，為后續(xù)的微藻應用奠定了基礎。

將微藻作為制備生物能源的新原料，無疑是克服化石能源短缺及環(huán)境污染、實現(xiàn)能源循環(huán)利用的新曙光[18-19]，由于微藻的種類和培養(yǎng)條件是微藻產油的重要影響因素[20]，試驗中篩選出的藻種DK-3具有較高的生物量及油脂產率，在自養(yǎng)條件下，其油脂產率(10.23±2.63)mg·L-1和油脂產量240.0～290.9 mg·L-1，是黃秋婷等[21]自養(yǎng)培養(yǎng)收獲四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)油脂產率為(187.6 mg·L-1)的1.28～1.53倍，是涂澤敏等[22]自養(yǎng)培養(yǎng)柵藻油脂產量(131.69 mg·L-1)的1.82～2.21倍。

微藻異養(yǎng)培養(yǎng)可以加快其生長速度，短期內獲得大量目標產物，但培養(yǎng)基組分對培養(yǎng)特性和油脂產率十分重要。葡萄糖是最常見的有機碳源，需求量高；磷元素是構成微藻細胞結構的重要元素，參與微藻蛋白質、脂肪、碳水化合物等物質的合成[23-24]；鎂元素是光合作用和呼吸作用過程中的重要酶，如各種磷酸激酶和磷酸變位酶的激活劑，同時也是葉綠素合成的重要成分，還可作為DNA和RNA合成過程的催化劑，對微藻的生長有舉足輕重的影響[25]。

MgSO4·7H2O含量對微藻生物量影響最為顯著，微藻生物量隨著MgSO4·7H2O含量的逐漸增高，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，原因可能為MgSO4·7H2O濃度較低時，Mg2+供應不足，抑制了其增殖，而MgSO4·7H2O濃度較高時，Mg2+供應過量，可與培養(yǎng)基中的K+、Al3+等離子產生拮抗作用，同時溶液滲透壓也隨之升高，反而抑制微藻細胞的生長。葡萄糖含量對微藻細胞生物量的影響僅次于MgSO4·7H2O，微藻生物量隨著葡萄糖含量的逐漸增高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，當葡萄糖濃度過低時無法為微藻細胞提供足夠的有機碳源，抑制微藻細胞生長；當葡萄糖濃度過高時，微藻初始生長過于迅速，在短時間內達到峰值，除葡萄糖以外的營養(yǎng)元素消耗過快，同時導致代謝產物濃度較高，使得微藻細胞數(shù)量迅速降低。微藻生物量隨著K2HPO4·3H2O含量的逐漸增高呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，主要原因可能是K2HPO4·3H2O濃度過低時無法滿足微藻細胞的生長，K2HPO4·3H2O濃度過高時，高濃度的K+可與培養(yǎng)基中的多種離子產生拮抗作用，同時磷元素的含量過高，導致氮磷失衡，抑制微藻細胞分裂繁殖，生物量降低。因此，選擇適宜的葡萄糖、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O濃度能夠有效提高微藻的生物量。

雖然，微藻異養(yǎng)培養(yǎng)能提高微藻的生物量和生長速率，但以葡萄糖作為碳源培養(yǎng)微藻價格昂貴，尋找價格低廉的碳源十分重要?？諝庵械腃O2可作為備選碳源[26]，已有研究將煙囪中的廢氣作為碳源[15]，可大大降低培養(yǎng)成本。同時選擇合適的光生物反應器也可進一步提高微藻的生物量及油脂含量[27]，本團隊后續(xù)將進一步展開深入研究。