董潞娜, 曹浩, 張欣宇, 王海勝

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081

二氫槲皮素(dihydroquercetin，DHQ)，別名花旗松素(taxifolin)。它存在于多種植物中，在落葉松中含量較高，特別是花旗松[1]。二氫槲皮素最早由日本學(xué)者Fukui從針葉植物Chamaecyparisobtusa葉中提取分離，近年來，在很多水果中也發(fā)現(xiàn)了二氫槲皮素的存在，如葡萄、橘子和西柚等[2]。二氫槲皮素結(jié)構(gòu)的特殊性，決定了其具有較強的抗氧化特性[3-6]、調(diào)節(jié)酶活等[7-8]多種生物活性。因此，二氫槲皮素在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用，市場需求量巨大。但是，目前二氫槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)仍然依賴于傳統(tǒng)的植物提取，原料稀缺、提取難度大、產(chǎn)率較低等缺點阻礙了其工業(yè)化應(yīng)用的推進。本文主要綜述了二氫槲皮素的基本性質(zhì)和生物合成途徑、生物學(xué)活性和生產(chǎn)工藝，并對二氫槲皮素以后的研究方向進行了展望，以期為二氫槲皮素的生物合成研究提供理論參考。

1 二氫槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

圖1 二氫槲皮素分子式Fig.1 Molecular formula of dihydroquercetin

2 二氫槲皮素的生物合成途徑及關(guān)鍵基因

2.1 二氫槲皮素的生物合成途徑

目前，二氫槲皮素的生物合成過程已基本探明，涉及到苯丙烷和類黃酮兩個階段(圖2)。在苯丙烷途徑中，在苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase，PAL)的催化下，來源于莽草酸途徑的苯丙氨酸脫去1個氨基生成肉桂酸；接著肉桂酸經(jīng)過肉桂酸羥化酶(cinnamate 4-hydroxylase，C4H)的催化作用獲得1個羥基，生成對香豆酸；在4-香豆酰輔酶A連接酶(coumaryl 4-ligase，4CL)的催化下，對香豆酸發(fā)生硫酯化反應(yīng)，生成對香豆酰輔酶A。1分子的對香豆酰輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A在查耳酮合成酶(chalcone synthase，CHS)的催化下進行縮合，生成柚皮素查爾酮，它是類黃酮物質(zhì)合成的起點。然后柚皮素查爾酮在查爾酮異構(gòu)酶(chalcone Isomerase，CHI)的催化下生成柚皮素。類黃酮途徑中，柚皮素在黃烷酮3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)的催化下生成二氫黃酮醇類物質(zhì)。二氫槲皮素可由二氫黃酮醇經(jīng)類黃烷酮3-羥化酶(flavanone 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H)催化生成[10-14]。同時，該過程也可先經(jīng)F3′H催化，再經(jīng)F3H催化。在類黃酮途徑中涉及到2個基因F3H和F3′H，它們是二氫槲皮素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因。

圖2 二氫槲皮素的生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis of dihydroquercetin

2.2 F3H基因

F3H基因的cDNA最早于1991年從金魚草(Antirrhinummajus)中分離克隆得到[15]。到目前為止，其已在多種植物中被克隆，如棗(ZiziphusjujubaMill.)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、茶樹(Camelliasinensis)等[16-19]。F3H基因以單拷貝形式存在[20]，在進化上十分保守[21-22]。F3H的作用底物是柚皮素和圣草酚，它調(diào)控著黃酮類物質(zhì)與花青素苷的合成，是黃酮類化合物代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一[23]。經(jīng)過對來自矮牽牛的F3H研究表明，F(xiàn)3H是一種單體蛋白，分子量約為42 kD，該蛋白中Ser290、His220、Arg222和His278等氨基酸殘基能夠較為明顯地對酶活性產(chǎn)生影響[24]。它主要催化柚皮素C3位的羥基化，生成二氫山奈酚(dhiydorkaempeforl，DHK)，催化過程需要2-酮戊二酸、分子氧、鐵和抗壞血酸的參與。此外，研究表明，在不同植物或組織中，F(xiàn)3H具有底物特異性[25]。

2.3 F3′H基因

F3′H基因最早由Brugliera等從矮牽牛(Petuniahybrida)中分離得到，經(jīng)鑒定屬于細胞色素P450亞家族[26-27]。此后，相繼在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、矢車菊(Centaureacyanus)、金魚草(Antirrhinummajus)、紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)、葡萄(Vitisvinifera)、蘋果(Malusdomestica)等多種植物中克隆得到了F3′H基因[13,28-31]。不同植物F3′H基因的cDNA系列的相似性為69.5%[32]。F3′H可以催化底物為柚皮素(naringenin)和DHK的3′位置發(fā)生羥基化反應(yīng)，分別生成花青素和原花青素生物合成所需的重要中間產(chǎn)物圣草酚(eriodictyol)和DHQ[33]。而花青素和原花青素可以保護植物細胞免受紫外線照射造成的傷害[34]。將多種植物F3′H蛋白的氨基酸序列比對之后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3′H存在于多種植物中高度保守的細胞色素P450結(jié)構(gòu)域“LPPGP”，它可以使F3′H穩(wěn)定錨定在微粒體膜上[35]。

3 二氫槲皮素的生物學(xué)活性

3.1 二氫槲皮素對肝臟細胞的影響

肝臟是人體內(nèi)的重要器官，它以代謝功能為主，并在身體內(nèi)起著去氧化、儲存肝糖原以及合成分泌性蛋白質(zhì)等作用。肝臟健康對于維持人體健康至關(guān)重要。國內(nèi)外大量的研究表明，DHQ對肝臟具有較好的保護作用，對肝臟疾病的治療有著巨大的潛力[36-40]，其作用機制包括：①激活或抑制相關(guān)酶的活性；②調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達；③誘導(dǎo)細胞自噬等。

DHQ可以通過調(diào)節(jié)酶活和減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累來改善機體氧化和血糖過高的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，DHQ以劑量依賴型的方式抑制對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)肝細胞壞死，并抑制乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的釋放，從而調(diào)節(jié)細胞外信號末端激酶(extracellular signal-terminal kinase，ERK-JNK)的應(yīng)激反應(yīng)。此外，DHQ還能夠減少ROS的積累、減輕線粒體的功能障礙等[36]。Ding等[37]的研究表明在高脂飲食/鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)大鼠中，添加劑量為100 mg·kg-1·d-1的DHQ可以顯著減弱尿微量白蛋白的排泄并穩(wěn)定血糖水平和脂質(zhì)代謝，減輕腎組織的病理學(xué)損傷；在體外研究中，DHQ可以顯著抑制細胞增殖和過量的ROS生成，并減少核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的激活和腎臟中腎纖維化相關(guān)蛋白的表達。

同時，DHQ對酒精性脂肪肝變性及其伴有的炎癥也有一定的抑制作用[38]。Zhang等[39]研究發(fā)現(xiàn)DHQ可以通過激活LKB1基因的表達增強腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)磷酸化來調(diào)節(jié)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP1和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)的表達；DHQ還可以上調(diào)SIRT1(負責(zé)去乙?；?的表達，下調(diào)P2X7R(負責(zé)促炎因子的合成與釋放)和NLRP3等轉(zhuǎn)錄因子的表達。綜上所述，DHQ可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達從而起到抑制脂肪生成和保肝的功效，提示DHQ對酒精性肝脂肪變性具有一定的治療潛力。

DHQ還可以在調(diào)節(jié)酶活的同時，介導(dǎo)細胞自噬。Chen等[40]利用刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷，發(fā)現(xiàn)DHQ給藥顯著降低了血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平，并提高了Con A處理小鼠的存活率，證明了DHQ可起到保肝作用；同時，研究了DHQ對刀豆球蛋白Con A誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的免疫調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，DHQ可以通過抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8(Caspase家族是一類與細胞凋亡有關(guān)的蛋白)的活化來保護HepG2細胞免受TNF-α/ActD誘導(dǎo)的細胞凋亡。

3.2 二氫槲皮素對心肌細胞的影響

DHQ還具有降低血壓、保護心肌缺血再灌注損傷和抑制心肌肥厚等作用。王秋紅等[41]研究發(fā)現(xiàn)DHQ能改善大鼠心電圖J點的位移，顯著降低心肌缺血大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量，提高心肌組織勻漿中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力，降低心肌組織勻漿中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛的含量，從而有效抑制異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)導(dǎo)致的心肌組織缺血，保護心肌細胞免受損傷，進而起到治療冠心病的作用。

而大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的抗氧化實驗結(jié)果表明，DHQ對離體大鼠缺血/再灌注損傷具有明顯的保護作用，此保護作用可能與DHQ可以減少氧自由基產(chǎn)生、提高氧自由基清除、降低脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)[42]。王知斌等[43]同樣發(fā)現(xiàn)二氫槲皮素對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞的損傷具有保護作用。其作用機制可能與其能夠提高細胞內(nèi)抗氧化酶活性、增強細胞穩(wěn)定性有關(guān)。

3.3 二氫槲皮素對淋巴細胞的影響

淋巴細胞在人機體免疫反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，而DHQ可以特異地抑制白血病淋巴病細胞的增殖，從而在一定程度上保護人的免疫系統(tǒng)。Devi和Das[44]研究了多種天然植物中的黃酮類活性物質(zhì)對人類普通淋巴白血病細胞系MoIt-4及其組織分化的成人淋巴細胞系IM-9的生長影響。其中，當(dāng)DHQ的濃度為10～50 μmol·L-1時，普通淋巴細胞中白介素-2(interleukin-2，IL-2)的分泌受到抑制，MoIt-4細胞中的IL-2水平升高，對IM-9細胞沒有影響。而IL-2分泌水平與MoIt-4細胞的生長抑制率有直接關(guān)系，故這一研究可能成為日后將DHQ等多種天然黃酮類物質(zhì)開發(fā)為治療急性淋巴白血病藥物的依據(jù)之一。

3.4 二氫槲皮素的抗炎抗氧化作用

由于DHQ結(jié)構(gòu)的特殊性，其抗炎、抗過敏、止癢作用也得到了廣泛研究[45-46]。DHQ能顯著對抗二甲苯所致的小鼠耳腫脹，緩解二硝基氯苯誘導(dǎo)的小鼠過敏反應(yīng)，并且能明顯減少4-氨基吡啶誘導(dǎo)的瘙癢反應(yīng)的舔體次數(shù)[40]。Borovskaya等[46]研究了DHQ對大鼠前列腺慢性非細菌性炎癥模型的作用。發(fā)現(xiàn)施用DHQ之后，大鼠前列腺中結(jié)締組織的面積減少至初始水平，這證明了該氧化劑的抗纖維化性質(zhì)。此外，DHQ還可以阻止腺泡上皮的萎縮，如研究發(fā)現(xiàn)DHQ的抗氧化能力對神經(jīng)細胞有保護作用，可以有效防治阿爾茲海默氏癥或帕金森氏病[47]；通過動物實驗也證明了DHQ的抗氧化能力使其具有抗心肌壞死的能力[48]。

3.5 二氫槲皮素的抗病毒作用

DHQ還被發(fā)現(xiàn)對病毒也有一定的抵抗性。DHQ對由柯薩奇病毒B4(Coxsackie virus B4，CVB4)引起的白色小鼠胰腺炎的影響實驗表明，DHQ的使用會導(dǎo)致胰腺組織中病毒滴度的劑量依賴性降低[49]。形態(tài)學(xué)上，與安慰劑治療的小鼠相比，經(jīng)過DHQ處理的小鼠的胰腺組織表現(xiàn)出較少的炎性細胞浸潤并且沒有組織破壞的跡象；經(jīng)過利巴韋林和DHQ處理的小鼠產(chǎn)生較少的胰腺炎癥病灶，并且這些病灶包含的浸潤細胞少于安慰劑治療的小鼠[49]。此外，DHQ的使用還可導(dǎo)致胰腺炎過程中受損的胰腺組織的抗氧化活性的恢復(fù)[49]。研究結(jié)果表明了DHQ的高抗病毒活性及其在治療復(fù)雜病毒性胰腺炎中的潛力。

3.6 二氫槲皮素對多種細胞內(nèi)酶的影響

DHQ能夠激活或抑制多種酶的酶活，從而產(chǎn)生不同的生理學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，DHQ可以作為α-淀粉酶的新型抑制劑[7]。利用不同濃度的DHQ處理后，測定α-淀粉酶的酶活，該化合物的半抑制濃度(inhibitory concentration，IC50)接近9 mmol·L-1，證明了它具有競爭性抑制的動力學(xué)機制；其抑制常數(shù)為(2.25±0.22) mmol·L-1，表明DHQ對酶的高親和力[7]。因此，DHQ對研究開發(fā)治療糖尿病的新藥具有重要意義。

此外，不同來源的DHQ對同一種酶的作用也會有所不同。付警輝等[8]研究了長白落葉松DHQ對酪氨酸酶的抑制作用，并與興安落葉松DHQ進行了對比。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在0.001～0.01 g·L-1時，長白落葉松DHQ對酪氨酸酶的抑制作用高于興安落葉松DHQ。長白落葉松DHQ低質(zhì)量濃度時，純度越高，對酪氨酸酶的抑制作用越強；高質(zhì)量濃度時，純度越高，抑制作用越弱。而且DHQ對酪氨酸酶表現(xiàn)為競爭性抑制，抑制常數(shù)KI為0.017。

3.7 二氫槲皮素的其他活性

除了以上活性，DHQ對腦部疾病也有一定的改善作用。Plotnikov等[50]研究發(fā)現(xiàn)DHQ可通過改善大鼠大腦皮層的微循環(huán)超微結(jié)構(gòu)從而改善腦部微循環(huán)，經(jīng)過DHQ處理的自發(fā)性高血壓(spontaneous hypertension，SHR)大鼠視皮層局部的腦血流量顯著高于未接受DHQ處理的大鼠，且接近京都種大鼠(Wistar-Kyoto，正常對照)的值。其原因可能是DHQ在動脈高血壓形成期間改善了SHR大鼠大腦皮層的微血管化。此外，DHQ還具有腸道保護作用，還可以通過促進骨代謝相關(guān)蛋白的表達影響骨代謝等[51]。

4 二氫槲皮素的生產(chǎn)工藝

雖然DHQ的生物學(xué)活性多樣，應(yīng)用廣泛，但目前其產(chǎn)量仍較低，生產(chǎn)方式還主要依賴于植物提取，包括有機試劑萃取、乙醇回流、超聲法、微波提取等方法，提取率較低且不環(huán)保。此外，還有采用化學(xué)試劑進行人工合成等，但此種方法合成的產(chǎn)物純度較低且原料成本較高。隨著國際、國內(nèi)市場對于黃酮類物質(zhì)需求量的快速增長，迫切地需要研發(fā)一種來源限制少、生產(chǎn)成本低、安全性高和污染排放低的方法進行生產(chǎn)，而微生物合成法或許可以成為解決該問題的關(guān)鍵方法。

4.1 植物提取法

由于DHQ主要以游離狀態(tài)存在于落葉松中，且含量高達7%，所以植物提取時主要選取落葉松為原料。在植物提取早期，主要采用溶劑提取法將DHQ從植物中提取出來。金建忠[52]以落葉松為原料，用80 ℃的沸水進行提取，再進一步將提取液沉淀之后用有機溶劑進行萃取、重結(jié)晶，最終的提取率達到0.29%。而劉妍和王遂[53]分別用水、丙酮-水作為提取溶劑從落葉松中提取DHQ，通過L9(34)正交實驗優(yōu)化了最佳提取條件，結(jié)果顯示以丙酮-水為提取劑的提取量高于以沸水作為提取劑的提取量。此外，吸附劑的加入也可提高提取率。如以落葉松木屑為原料，以90 ℃沸水為溶劑、聚酰胺為吸附劑提取DHQ，在此條件下DHQ的提取率為0.814%[54]。

后期出現(xiàn)了回流提取法、超聲-微波法和酶誘導(dǎo)法等多種提取方法。韓俊鳳和賈林艷[55]改進了傳統(tǒng)水熱提取法，采用微波輔助預(yù)處理來提取落葉松中的DHQ，平均提取率為0.981%。與傳統(tǒng)的水熱提取法比較，微波輔助提取效率提高了22.17%。同時，也有諸多研究表明，采用超聲輔助提取法可以不同程度地提高DHQ的提取率[56-58]。蘇丹等[59]對熱水回流提取法、乙醇回流提取法、微波提取法和乙醇超聲輔助提取法進行了比較，熱水回流提取和乙醇回流提取所用時間較長，120 min其提取率分別為0.17%和0.20%；微波和乙醇超聲提取時間較短，30 min時提取率分別為0.21%和0.22%，其提取率較前2種方法稍有提高。此外，Wang等[60]采用酶誘導(dǎo)法，使用因子設(shè)計和中心復(fù)合設(shè)計方法對興安落葉松木屑中DHQ的提取進行優(yōu)化。最優(yōu)條件為0.5 mg·mL-1纖維素酶和果膠酶0.5 mg·mL-1，在優(yōu)化條件下DHQ的得率分別增加到(1.06±0.08)～(1.35±0.04) mg·g-1。

可以看出，隨著提取工藝的不斷改進，不再單純以沸水作為提取試劑，且提取量有所提高。植物落葉松的提取工藝的提取率一般在1%～2%，純度在95%以上，可操作性也相對較強，但是這種工藝對植物資源和各種試劑的浪費較多，且存在不環(huán)保的缺點。

4.2 化學(xué)合成法

為了降低對植物資源的依賴，拓展DHQ的來源，各種化學(xué)合成的方法也被開發(fā)出來[61]，但在其研發(fā)過程中也面臨著諸多問題。孫淑香[62]以甲基氯甲醚為原料采用AFO(algar-flynn-olyamada)反應(yīng)法合成了DHQ，其回收率約為20%，但是甲基氯甲醚毒性較大，已有資料顯示接觸其蒸汽后催患肺癌的概率很高，因此，有學(xué)者正在尋找其他酚羥基保護劑做替代品。也有研究人員采用各種化學(xué)試劑(如過釕酸四丙胺鹽、AD-mix-α等)利用光延反應(yīng)法合成DHQ，回收率約為30%[63]，但這些試劑在我國國內(nèi)市場并不常見，若不解決這些試劑的獲取途徑，則該工藝不具備在國內(nèi)工業(yè)化的價值。胡昆等[64]將2,4,6-三羥基苯乙酮與3,4-二羥基苯甲醛進行甲氧甲氧基保護羥基、羥醛縮合、環(huán)氧化及脫保護關(guān)環(huán)反應(yīng)合成了DHQ，但此合成方法的純度并不高。此外，也可將其他天然產(chǎn)物作為原料，如可以將兒茶素作為原料利用半合成法制備DHQ，摩爾回收率約為5%[65]，但需要注意的是，兒茶素的市場價格約為1 000元·kg-1，可以計算得出，該工藝生產(chǎn)二氫懈皮素的成本在20 000元·kg-1左右，遠超過提取法的成本。

4.3 生物合成法

目前基于生物合成法的研究仍處于實驗室階段，尚未進行大規(guī)模生產(chǎn)。Leonard等[66]對大腸桿菌進行代謝工程改造，在大腸桿菌內(nèi)異源表達多種黃酮代謝相關(guān)的酶類，當(dāng)使用黃烷酮為前體分子時，從工程菌株中生物合成了B環(huán)三羥基黃酮醇楊梅素，并少量檢測到多種類黃酮物質(zhì)的存在。也有研究表明，可將茶樹類黃酮3′-羥基化酶(F3′H)基因應(yīng)用于圣草酚、二氫槲皮素和槲皮素的生物合成[67-68]。

而本實驗室基于二氫槲皮素的生物合成途徑，主要對由柚皮素向二氫槲皮素合成的方向進行了研究，篩選了3種不同植物來源(大豆、茶樹、銀杏)的F3H基因，并將其在大腸桿菌和釀酒酵母中進行了異源表達，現(xiàn)已證實均有活性且表達量較高(未發(fā)表數(shù)據(jù))。綜上，相較于化學(xué)合成法來說，生物合成法更為環(huán)保，研究潛力較大。

5 展望

二氫槲皮素作為一種重要的黃酮類化合物，普遍存在于多種植物中，由于其在抗炎、抗病毒、抗氧化等方面的突出作用，其藥理活性正被逐步探究并被廣泛應(yīng)用于保健品、藥品、食品等領(lǐng)域。2018年3月21日，歐盟委員會發(fā)布了2017/461號法規(guī)，此項法規(guī)正式授權(quán)了二氫槲皮素提取物可以作為新的食品成分進入歐盟市場。此外，二氫槲皮素可用于治療腦梗及其后遺癥、腦血栓、心臟冠狀動脈等疾病，應(yīng)用于調(diào)節(jié)脂代謝、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒、抗腫瘤等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，均具有較大的開發(fā)潛力。

然而，二氫槲皮素在研究過程中仍存在以下問題。①對于二氫槲皮素應(yīng)用過程中的毒副作用研究甚少，該物質(zhì)應(yīng)用于臨床治療仍需要大量的研究來確保其安全性。②由于二氫槲皮素水溶性較差,傳統(tǒng)的提取工藝復(fù)雜且效率低等一些生產(chǎn)工藝問題，尚未實現(xiàn)大規(guī)模自動化生產(chǎn)，這種情況使得目前二氫槲皮素單價較高，在各領(lǐng)域應(yīng)用中的利用度很低。當(dāng)下，代謝工程、合成生物學(xué)快速發(fā)展，而二氫槲皮素的基因工程菌株構(gòu)建的研究報道鮮有報道，因此構(gòu)建良好的基因工程菌將是解決其大規(guī)模應(yīng)用的重要途徑。