張鳳琴

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽巢湖238000）

嗜熱菌是一類最適宜生長(zhǎng)溫度高于50°C，最低生長(zhǎng)溫度不低于30°C，最高生長(zhǎng)溫度在60°C以上的極端環(huán)境微生物[1-2]。對(duì)嗜熱菌的研究，國(guó)外起步較早，在美國(guó)、冰島、俄羅斯及新西蘭等地均有大量嗜熱菌的分類種群被發(fā)現(xiàn)[3-5]。近幾年來，國(guó)內(nèi)在嗜熱菌研究領(lǐng)域也有不少收獲，在云南、廣州、四川、福建、臺(tái)灣和江西等地的多處溫泉中有一些嗜熱菌被分離鑒定[6-8]。嗜熱菌因其超強(qiáng)的耐熱性和獨(dú)特的生理生化特性，在生物科學(xué)研究及工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域都有著獨(dú)特的作用[9]，嗜熱菌產(chǎn)生的嗜熱酶及其菌體均具有很廣闊的應(yīng)用前景。嗜熱菌的嗜熱酶在高溫下具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，可用于需要高溫催化的食品、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、能源等領(lǐng)域，如嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)生的高溫α-淀粉酶可使淀粉完全轉(zhuǎn)化為右旋葡萄糖，嗜熱酶可生產(chǎn)新型藥物，嗜熱酶可降解芳香族化合物、氰化物、有機(jī)磷農(nóng)藥等難降解物質(zhì)，嗜熱菌產(chǎn)生的纖維素酶在乙醇發(fā)酵中，可提高乙醇產(chǎn)量。嗜熱菌菌體可直接用于工業(yè)中，如硫化細(xì)菌可用于硫化礦的生物瀝濾和煤炭的脫硫過程[10]。

廬江湯池地?zé)豳Y源豐富，嗜熱菌研究潛力大，但目前仍未見對(duì)廬江地區(qū)嗜熱菌的研究報(bào)道。本研究從廬江湯池溫泉水（約60 ℃，pH 7.0）中分離嗜熱菌，對(duì)分離得到的嗜熱菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性研究，為其在以后的科學(xué)研究及工業(yè)應(yīng)用提供理論支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采集于廬江湯池溫泉，東經(jīng)117°01′、北緯31°33′。細(xì)菌DNA 提取試劑盒和PCR 膠回收試劑盒，購(gòu)自大連TaKaRa公司；引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L，調(diào)節(jié)pH 至7.2～7.4（固體培養(yǎng)基添加瓊脂14.0 g/L）。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等藥品均為國(guó)產(chǎn)生物級(jí)。

1.2 方法

（1）嗜熱菌分離純化

?。?.2～0.3）mL溫泉水，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，60°C下恒溫培養(yǎng)24 h。經(jīng)過反復(fù)多次純化直至得到單菌落。

（2）菌株的分子生物學(xué)鑒定

菌株基因組DNA 的提取參照細(xì)菌DNA 試劑盒（大連TaKaRa 公司）操作。采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA 基因序列并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序（上海生工生物工程有限公司）。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA6的Neighbor joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定菌株的系統(tǒng)分類地位。

（3）菌株的形態(tài)觀察

將純化菌株用平板劃線法接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，60°C恒溫培養(yǎng)24 h。觀察菌落生長(zhǎng)情況、形態(tài)、大小、表面、邊緣及顏色等各方面特征。挑取單菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)和革蘭氏分析。

（4）生理生化特性研究

生化特性鑒定。通過非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管對(duì)菌株的生化特性進(jìn)行鑒定。該試驗(yàn)選用的非發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管共包含14 個(gè)生化鑒定項(xiàng)目：精氨酸（Arginine）、鳥氨酸（Ornithine）、賴氨酸（Lysine）、氨基酸對(duì)照（Amino acid control）、枸櫞酸鹽（Citrate）、硝酸鹽還原作用（Nitrate reduction）、尿素（Urea）、七葉苷（Esculin）、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、蔗糖（Sucrose）、麥芽糖（Maltose）、木糖（Xylose）、葡萄糖（Glucose）、硫化氫（Hydrogen sulfide）和氧化酶（Oxidase）。

不同pH下的生長(zhǎng)情況。將菌液接種于pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中。于60°C、160 r/min條件下培養(yǎng)24 h。通過分光光度計(jì)測(cè)定菌體濃度，從而確定菌株生長(zhǎng)的pH 范圍及最適宜pH。

最高耐受溫度的確定。?。?.2～0.3）mL菌液，涂布到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，分別于60、65、70、75、80°C生長(zhǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，初步確定菌株最高耐受溫度范圍。確定范圍后，再在范圍內(nèi)以1°C為間隔，確定菌株具體的最高耐受溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

從湯池溫泉水中分離純化得到一株嗜熱菌，命名為L(zhǎng)JTC-1（NCBI登錄號(hào)：KT454966）。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到菌株LJTC-1的16S rRNA基因片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后與GenBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)，并將序列上傳至GenBank（接受號(hào)：KT454966）。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）與進(jìn)化關(guān)系比較親近的屬種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，得知菌株LJTC-1屬于Thermoactinomyces屬，且與Thermoactinomycessp.60X-8(JN578486.1)親緣關(guān)系最親近，二者在同一個(gè)進(jìn)化分支上。

圖1 LJTC-1菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 菌株的形態(tài)特征

LJTC-1菌落形態(tài)為白色、不透明、圓形、邊緣不規(guī)則、表面隆起、干燥、似毛狀、直徑在（3.0～5.0）mm，如圖2（a）所示。菌體經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，LJTC-1菌呈鏈珠狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，如圖2（b）所示。

圖2 菌株LJTC-1的菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢圖片

2.4 生理生化特征

（1）生理生化特性鑒定

菌株LJTC-1 在精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、氨基酸對(duì)照、枸櫞酸鹽、尿素、OPNG 及氧化酶試驗(yàn)中呈陽(yáng)性；在硝酸鹽還原反應(yīng)、七葉苷、硫化氫試驗(yàn)中呈陰性（見表1）。

表1 生理生化特征

（2）最適宜pH

初步測(cè)定菌株LJTC-1可生長(zhǎng)的pH范圍為5.5～9.0，最適宜pH約為7.5，如表2和圖3所示。

表2 不同pH下菌株生長(zhǎng)情況

圖3 pH對(duì)菌株的影響

（3）最高耐受溫度

通過初步實(shí)驗(yàn)確定菌株LJTC-1在（60～70）°C可生長(zhǎng)，在75 ℃以下無法生長(zhǎng)，如表3所示。由表3可確定該菌株最高耐受溫度范圍為（70～75）℃，為了進(jìn)一步確定耐受溫度，將該菌株放于71、72、73和74 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如表4所示。在74 ℃時(shí)菌株仍能生長(zhǎng)，而75 ℃不生長(zhǎng)，故確定其最高耐受溫度為74 ℃。

表3 不同溫度下菌株生長(zhǎng)情況（Ⅰ）

表4 不同溫度下菌株生長(zhǎng)情況（Ⅱ）

3 討 論

從研究結(jié)果可知，菌株LJTC-1 與Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）親緣關(guān)系最親近，Thermoactinomycessp.60X-8（JN578486.1）菌在（15～40）℃范圍內(nèi)可生長(zhǎng)[11]，而該菌最高耐受溫度為74 °C。由此推測(cè)廬江湯池地區(qū)獨(dú)特的地理?xiàng)l件和溫泉環(huán)境可能對(duì)造成菌株LJTC-1與親緣關(guān)系相近菌株間差異起到一定作用。

目前，分離得到的嗜熱菌最高耐受溫度多為（65～72）℃[12-14]，但Balwinder SS從垃圾堆放處篩選得到能耐受90 ℃高溫的嗜熱菌Geobacillus[4]，這可能與采樣點(diǎn)的高溫環(huán)境有關(guān)。嗜熱菌對(duì)高溫具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，主要與細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)與遺傳物質(zhì)有關(guān)。嗜熱菌的膜脂具有長(zhǎng)鏈和高飽和度的脂肪酸，能形成很強(qiáng)的疏水鍵，從而使細(xì)胞膜在高溫環(huán)境下保持正常的生理功能[15-16]；嗜熱菌蛋白質(zhì)穩(wěn)定的天然結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)的促進(jìn)熱穩(wěn)定因素，即嗜熱菌蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是其耐熱性的主要機(jī)制[17]；此外，嗜熱菌DNA結(jié)構(gòu)中G+C%含量較高且螺距較短，有利于DNA的穩(wěn)定，嗜熱菌tRNA周轉(zhuǎn)速度快且其G+C%含量高，因此其tRNA在高溫下的穩(wěn)定性較好，故嗜熱菌的耐熱性與其遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性有關(guān)[18-19]。

安徽廬江湯池地區(qū)地?zé)豳Y源豐富，開發(fā)潛力大。但目前仍未有關(guān)于廬江湯池地區(qū)的嗜熱菌研究，此研究是第一篇關(guān)于廬江湯池溫泉中嗜熱菌的文章，所分離鑒定的菌株LJTC-1是目前唯一一株從廬江湯池溫泉中分離得到的嗜熱菌。該研究結(jié)果可以為當(dāng)?shù)卣畬?duì)廬江湯池溫泉資源保護(hù)和開發(fā)利用提供理論支持，并為其在以后的科學(xué)研究及工業(yè)應(yīng)用方面提供參考。后續(xù)將對(duì)該菌的高溫酶進(jìn)行特性研究并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找出其與親緣關(guān)系相近菌株高溫酶之間的差異，并對(duì)嗜熱菌和其高溫酶的應(yīng)用進(jìn)行研究，通過分子生物學(xué)手段將嗜熱酶在性狀更優(yōu)良的微生物中進(jìn)行克隆表達(dá)[20]。