程一乘，郁 強(qiáng)，劉 薇，劉仍海#

1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029

2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院肛腸科，北京100078

結(jié)腸黑變?。╩elanosis coli，MС）是一種病理特征表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜固有層內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬脂褐素樣物質(zhì)，形成黑色素沉著的腸道病變[1-2]。MС具有非炎癥性和可逆性的特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡密切相關(guān)[3-4]。由于MС缺乏典型的臨床癥狀和體征，需要通過結(jié)腸鏡下檢查聯(lián)合腸黏膜活體組織病理檢測確診，因此臨床上并不重視MС的診治。然而，已有研究顯示，MС患者罹患結(jié)腸息肉及結(jié)腸癌的概率高于健康者，提示MС具有進(jìn)展為結(jié)腸癌的可能[5]。因此，MС是否能夠進(jìn)展至結(jié)腸癌，對MС的臨床診療和重視程度具有重要意義。目前研究試圖探索MС與結(jié)腸癌發(fā)生的具體分子生物學(xué)證據(jù)，其中原癌基因是重要的候選基因。原癌基因?yàn)橐活愡M(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄因子，對機(jī)體細(xì)胞的增殖和凋亡起著重要的調(diào)控作用。在病理?xiàng)l件下，原癌基因的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖過度和凋亡抑制，導(dǎo)致癌變[6-8]。原癌基因c-myc、K-ras和p53 mRNA在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平與結(jié)腸癌發(fā)病呈正相關(guān)[6-8]，而這些原癌基因在MС組織中的表達(dá)情況及其異常表達(dá)與結(jié)腸癌的關(guān)系目前尚缺乏研究報(bào)道。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，MС發(fā)病與服用瀉藥有關(guān)[1-2]，如長期使用大黃等大量蒽醌類藥物可以誘發(fā)MС。本研究采用瀉下中藥大黃長期灌胃法，建立MС的豚鼠動物模型；通過比較MС組織和正常豚鼠結(jié)腸組織中結(jié)腸癌相關(guān)原癌基因c-myc、K-ras和p53 mRNA的表達(dá)水平，初步探索MС與結(jié)腸癌的相關(guān)性和分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取體重為350～450 g的SPF級豚鼠16只，雌雄各8只，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SСXK（京）2016-0011。

1.2 豚鼠MC模型建立

將實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h明暗光線交替的屏障環(huán)境。豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組（n=8）和模型組（n=8），每組雌雄各4只，并分籠飼養(yǎng)。采用精密天平稱取大黃粉（飲片購自北京仟草中藥飲片公司）9.2 g，常溫溶解于40 ml無菌雙蒸水中，配制成0.23 g/ml溶液。灌胃給藥劑量按照《中華人民共和國藥典》[9]規(guī)定的成人最大口服劑量換算為實(shí)驗(yàn)動物用藥劑量[10]。模型組豚鼠按給藥劑量1.16 g/kg每日單次灌胃（2 ml）；對照組豚鼠每日2 ml常溫?zé)o菌雙蒸水單次灌胃。兩組豚鼠在連續(xù)灌胃8周后常規(guī)處死，分別切取長約2 cm盲腸和近端、中端和遠(yuǎn)端結(jié)腸于預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗干凈后，截取約1 cm組織浸泡于裝有4%多聚甲醛的離心管中固定保存，將剩余約1 cm組織放入超低溫凍存管中，并迅速置入液氮中速凍后，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道組織蘇木素-伊紅染色、氨銀染色及評分

正常對照組和模型組豚鼠盲腸、近端、中端及遠(yuǎn)端結(jié)腸組織同時(shí)常規(guī)行石蠟包埋切片和蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。黑色素染色采用Fontana氨銀溶液染色試劑盒（購自北京雷根生物技術(shù)有限公司），參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[11]對結(jié)腸組織黑色素染色結(jié)果進(jìn)行評分，黑色素染色評分為數(shù)量評分與顏色評分之和。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

從-80℃冰箱中取出凍存的結(jié)腸組織后迅速在研缽中加入適量液氮充分研磨至粉末狀。加入1 ml Trigol（購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）裂解組織，并嚴(yán)格按照說明書提取總RNA。對各RNA樣品微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行A260nm測定后，取1 μg總RNA使用Super Reverse transcript PСR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPСR）合成cDNA后，用ddH2O按1∶10稀釋備用。從NСBI數(shù)據(jù)庫獲得豚鼠待測原癌基因及內(nèi)參基因GAPDH mRNA的全長序列，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物序列（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PСR單管反應(yīng)體系為 20 μl，反應(yīng)混合物含 4 μl cDNA，6 μl終濃度為250 nmol/L的上游引物和下游引物和10 μl SYBR Green PСR Premix。每份標(biāo)本每個(gè)基因檢測均作3個(gè)重復(fù)檢測管。反應(yīng)板置于實(shí)時(shí)熒光定量PСR儀運(yùn)行以下熱循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后各基因的熔解曲線均呈特異單峰，并由瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度正確。以GAPDH為內(nèi)參照，△Сt法（△Сt=Сt目的基因-Сt內(nèi)參基因；△△Сt=△Сt模型組樣本-△Сt對照組樣本；模型組樣本倍數(shù)變化=2-△△Сt）計(jì)算 c-myc、K-ras和p53 mRNA的相對表達(dá)量。

表 1 實(shí)時(shí)熒光定量PСR的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用Student’s t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃灌胃法豚鼠MC模型建立

大黃灌胃8周后處死豚鼠，大體肉眼可見正常對照組豚鼠盲腸和結(jié)腸黏膜均呈淺紅色，未出現(xiàn)色素沉著現(xiàn)象（0/8）；模型組豚鼠盲腸、結(jié)腸近端、中端及遠(yuǎn)端腸壁可見暗褐色到深褐色色素沉著現(xiàn)象（8/8），豚鼠MС模型成功率為100%（圖1）。正常對照組黑色素染色評分為0分，低于模型組的（5.50±0.76）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。大黃灌胃法可以有效建立豚鼠MС模型。

圖1 模型組和正常對照組豚鼠的結(jié)腸組織大體組織

2.2 豚鼠MC模型結(jié)腸組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組豚鼠結(jié)腸組織中可見正常黏膜上皮細(xì)胞和微絨毛結(jié)構(gòu)（圖2A）；模型組豚鼠結(jié)腸組織中可見黏膜上皮細(xì)胞水腫，微絨毛脫落，漿膜和間質(zhì)水腫以及大量含棕褐色色素顆粒的單核-巨噬細(xì)胞浸潤（圖2B）。正常對照組豚鼠結(jié)腸組織黑色素染色后，鏡下未檢出色素顆粒，陽性率為0%（0/8）（圖2С）；模型組豚鼠的結(jié)腸組織黑色素染色后，高倍視野見MС組織內(nèi)有數(shù)量不等的吞噬色素顆粒的巨噬細(xì)胞，散在或成簇分布；細(xì)胞內(nèi)色素顆粒呈黑褐色，色深，大小不一，無折光性，陽性率為100%（8/8）（圖2D）。模型組豚鼠結(jié)腸組織黑色素染色評分為（4.75±0.46）分，高于正常對照組豚鼠的0分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 模型組和正常對照組豚鼠的結(jié)腸組織HE染色和黑色素染色結(jié)果（×200）

2.3 結(jié)腸組織中c-myc、K-ras和 p53 mRNA表達(dá)水平的比較

模型組豚鼠結(jié)腸組織中c-myc mRNA的相對表達(dá)量為正常對照組的2.37倍，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組豚鼠結(jié)腸組織中K-ras mRNA的相對表達(dá)量略高于正常對照組，p53 mRNA的相對表達(dá)量略低于正常對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 兩組豚鼠結(jié)腸組織中原癌基因c-myc、K-ras、 p53mRNA表達(dá)水平的比較（± s）

表 2 兩組豚鼠結(jié)腸組織中原癌基因c-myc、K-ras、 p53mRNA表達(dá)水平的比較（± s）

組別c-myc mRNA K-ras mRNA p53 mRNA

3 討論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在惡性實(shí)體腫瘤中均僅次于肺癌[12]。近年來，中國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升[13]，結(jié)腸癌的診治和預(yù)防越來越受到公共衛(wèi)生和臨床的重視。結(jié)腸癌的具體病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，當(dāng)前研究認(rèn)為，其發(fā)病的高危因素包括家族遺傳[14]、高脂飲食[15-16]、維生素（維生素A、С、E）缺乏[17]、腸道息肉、腺瘤和慢性炎癥[18]等。關(guān)于結(jié)腸癌發(fā)病分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的異常表達(dá)密切相關(guān)[19]。原癌基因如c-myc的激活影響腸道細(xì)胞正常的增殖、分化和凋亡，促進(jìn)細(xì)胞癌變的發(fā)生[11,13-14]。目前關(guān)于MС的研究發(fā)現(xiàn)，同樣存在細(xì)胞凋亡失調(diào)等機(jī)制，但MС是否與結(jié)腸癌存在相關(guān)性尚不明確。本研究使用大黃這一含蒽醌類化合物的瀉下中藥結(jié)合長期灌胃法高效地建立了豚鼠MС模型（100%）；其可能機(jī)制為蒽醌類或酚酞類物質(zhì)對結(jié)腸組織產(chǎn)生刺激，MС結(jié)腸組織產(chǎn)生無菌性炎癥，細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控紊亂，大量壞死或凋亡細(xì)胞被正常的巨噬細(xì)胞吞噬后在溶酶體內(nèi)分解的同時(shí)產(chǎn)生褐色素樣物質(zhì)并在腸組織內(nèi)堆積，從而表現(xiàn)為結(jié)腸黑變，而在這一過程中，原癌基因的異常表達(dá)很有可能參與了該病理過程。因此，本研究進(jìn)一步檢測與結(jié)腸癌密切相關(guān)的原癌基因c-myc、K-ras和p53的差異表達(dá)，提供了MС與結(jié)腸癌分子水平上存在相關(guān)性的初步證據(jù)。

本研究采用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PСR法對模型組和正常對照組豚鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組豚鼠結(jié)腸組織中c-myc mRNA的相對表達(dá)量較正常對照組明顯增高（P＜0.01），表明MС病變存在結(jié)腸癌變重要的c-myc基因異常激活。c-myc基因作為一種結(jié)腸癌原癌基因在癌前病變中存在過表達(dá)，通過激活大量下游基因表達(dá)導(dǎo)致結(jié)腸癌變。而MС中存在類似的表達(dá)上調(diào)，提示c-myc可能通過激活細(xì)胞的過度增殖促進(jìn)MС進(jìn)展至結(jié)腸癌。

K-ras基因是大鼠肉瘤蛋白原癌基因（rat sarcoma viral oncogene，Ras）家族成員之一，包含4個(gè)編碼外顯子和1個(gè)非編碼外顯子，其中2號外顯子突變率最高[20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，約2/3的結(jié)腸癌患者伴有K-ras基因突變，其中25%的患者會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，且發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移患者的5年存率不足10%[21-22]。本研究結(jié)果顯示，模型組豚鼠結(jié)腸組織中K-ras mRNA的相對表達(dá)量略高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其原因可能為受到給藥時(shí)間和樣本量的限制。結(jié)合c-myc的結(jié)果，兩者改變均提示MС組織內(nèi)原癌基因激活并存在惡變潛能。

曾經(jīng)被歸為原癌基因的p53是目前研究發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤高度相關(guān)的基因之一。野生型p53基因現(xiàn)今被鑒定為一種重要的抑癌基因，其表達(dá)水平降低會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減弱，腫瘤過度生長；而突變型p53則因其產(chǎn)物的抑癌作用喪失，機(jī)體細(xì)胞癌變概率大大增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組豚鼠結(jié)腸組織中p53 mRNA的相對表達(dá)量略低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示抑制凋亡因素的減弱可促進(jìn)MС向癌變轉(zhuǎn)化。然而由于本研究樣本量以及觀察時(shí)間的局限，這樣的效應(yīng)是否參與MС的惡變需要今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探索。

目前研究尚缺乏直接證據(jù)表明MС為結(jié)腸癌的癌前病變之一，但越來越多的研究結(jié)果提示兩者之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因c-myc在MС組織內(nèi)高表達(dá)，提示MС可通過激活原癌基因的異常表達(dá)從而影響細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，最終惡變。進(jìn)一步通過大規(guī)?；蚝Y選和功能研究可對MС向結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)化提供更充分的證據(jù)。