高瓊，馮紅超，唐正龍，馬洪，段曉峰，毛本源#

1貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽550004

2貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽5500060

涎腺惡性腫瘤多為涎腺上皮組織來源的惡性腫瘤，可發(fā)生于大涎腺如腮腺、頜下腺和舌下腺，也可發(fā)生于小涎腺如腭腺等，具有組織分型多、細胞成分復雜等特點[1]。血液供應是包括涎腺惡性腫瘤在內的各種實體瘤生長的必要條件，腫瘤內血管系統(tǒng)的建立可以通過多種方式進行，腫瘤細胞的生長和轉移均依賴于腫瘤內新血管的生成。Maniotis等[2]于1999年在研究人眼侵襲性葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現一種與經典的血管生成途徑不同的血管生成模式——血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）。腫瘤細胞可以通過VM管道結構獲得宿主的血液供應，從而為腫瘤組織的進行性生長、浸潤和轉移提供足夠的血液供應[3-4]。VM是指由高度惡性腫瘤細胞形成的無內皮細胞參與的、由細胞外基質界限的具有輸送血液功能的管腔結構，因此，存在VM結構的惡性腫瘤常具有高度惡性、高轉移性、高侵襲性的特點[5]。在臨床上，涎腺惡性腫瘤的發(fā)病率雖然較低，但是其惡性程度及轉移率均高，易復發(fā)，預后較差[6]。隨著治療手段的不斷深入更新，目前手術切除是治療涎腺惡性腫瘤的最常用手段，但是盡管行根治性手術切除，涎腺惡性腫瘤患者的5年生存率仍僅約為40%，嚴重威脅著患者的生命健康[7]。因此，研究涎腺惡性腫瘤中有無VM形成，有利于明確腫瘤浸潤和轉移的機制，對于涎腺惡性腫瘤的治療有重大意義。基于此，本研究通過對人涎腺惡性腫瘤石蠟標本進行常規(guī)組織學檢查及免疫組化結合的雙重染色，初步研究涎腺惡性腫瘤中是否存在VW結構，觀察不同類型涎腺惡性腫瘤與VM結構的形成有無聯系，探討腺樣囊性癌的生物學特征與VM的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2003—2011年貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院保存的經手術切除、福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋的，并經過病理證實的涎腺惡性腫瘤患者的涎腺惡性腫瘤組織標本43例；同時，選取貴州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院同期保存的因外傷而行常規(guī)手術切除患者的正常涎腺組織標本5例為對照。43例涎腺惡性腫瘤患者中，男23例，女20例；5例外傷患者中，男2例，女3例。

1.2 主要試劑與儀器

Mouse anti-СD31鼠抗人СD31單克隆抗體、濃縮型DAB顯色試劑盒、PV-9000二步法免疫組化檢測系統(tǒng)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 檢測方法

將獲取的所有組織標本蠟塊進行連續(xù)切片，厚度約為4 μm，將石蠟切片放置于防脫載玻片后，再放置于60℃的烤箱中固定6小時，裝盒備用。分別進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色復查診斷、組織分型及СD31+PAS雙重染色。先將涎腺惡性腫瘤切片按照常規(guī)進行HE染色，光鏡下觀察結果，復查病理診斷。將組織切片用二甲苯各浸泡10 min；之后采用梯度乙醇進行水化。最后用PBS沖洗以去除切片上殘留的乙醇，每次大約5 min。取適量檸檬酸緩沖溶液（pH=6.0）于熱修復專用切片盒中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，將切片置于緩沖液中，繼續(xù)加熱至噴漆后3 min。室溫下冷卻，蒸餾水洗。后滴加3%的H2O2，烤箱中37℃孵育20 min。之后采用PBS反復沖洗。每張標本切片滴加1滴一抗（anti-СD31），置于4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，次日取出標本切片，恢復至室溫，反復沖洗。每張標本切片滴加1滴試劑A（聚合物增強劑），孵育20 min，之后用PBS沖洗。擦干后每張標本切片滴加試劑B[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）聚合物]，37℃孵育30 min，之后用PBS液沖洗3次。二氨基聯苯胺顯色7 min，待血管內皮細胞著色后，自來水沖洗4 min，終止顯色反應。將標本切片置于0.5%的過碘酸溶液中還原后再置于Schiff液中，反應約15 min。取出標本切片，用蒸餾水反復沖洗3次，每次1 min，之后再流水沖洗3～5 min。蘇木精襯染細胞核1 min，自來水沖洗2 min。鹽酸酒精分化，自來水返藍。常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。進行觀察。

1.4 判定標準

VM判斷標準：內皮細胞是血管壁的重要組成部分，СD31是重要的內皮標志物，СD31陽性結果為主要位于細胞膜上呈棕黃色顆粒著色。本實驗為區(qū)別內皮依賴性血管，選擇СD31作為鑒別分子。同時腫瘤細胞基底膜經PAS染色后相應部位呈淡粉色或櫻桃紅著色。參考Maniotis等[2]方法，在光鏡下觀察，病理切片中觀察到СD31標記的內皮性血管，其PAS染色也為陽性。以及СD31染色為陰性，由腫瘤細胞構成管壁的管腔樣結構。

微血管密度（microvessel density，MVD）：參考Weidner校正方法[8]，先在光學顯微鏡低倍鏡下尋找血管密集的熱點（hot spot）區(qū)域，然后計數3～5個高倍視野內的微血管，取其平均數即為該腫瘤的MVD。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 涎腺惡性腫瘤CD31和PAS雙重染色結果分析

PAS染色結果顯示，漿液腺泡，呈紅色（圖1A）；黏液腺泡，為無色；漿黏液腺泡，呈淺紅色（圖1B）。43例涎腺惡性腫瘤組織的СD31和PAS雙重染色結果顯示，顯微鏡下觀察發(fā)現，典型的管道樣擬態(tài)結構由腫瘤細胞構成，管壁無內皮細胞，管腔內有紅細胞存在，很少見壞死的腫瘤細胞及炎細胞。說明VM是由腫瘤細胞擬血管生成的一種具有血管功能的血管通路。因此VM結構在顯微鏡下表現為由腫瘤細胞圍成的管道樣結構，內有紅細胞。構成管腔的腫瘤細胞及腫瘤細胞與紅細胞之間均無СD31染色陽性物質存在，表明無內皮細胞參與此管道的構建。在紅細胞和腫瘤細胞之間有PAS陽性物質間隔，也有部分管腔中有PAS染色陽性物質填充。在涎腺惡性腫瘤中也發(fā)現了PAS陽性網絡結構，此結構成條索狀，內無管腔，可見部分條索結構與內皮依賴性血管相接，而內皮性血管在顯微鏡下可見СD31染色陽性的內皮圍成管腔樣或網狀結構，有時內皮可見PAS染色陽性的基質（圖2）。5例正常腺體組織的СD31和PAS雙重染色結果顯示，未發(fā)現VM結構（圖3）。

圖3 СD31和PAS在正?？谇幌袤w組織中的表達情況（PV法，×400）

2.2 涎腺惡性腫瘤組織和正?？谇幌袤w組織中VM情況

43例涎腺惡性腫瘤中，腺樣囊性癌33例，黏液表皮樣癌4例，多形性腺瘤3例，腺泡細胞癌2例，肌上皮癌1例。СD31和PAS雙重染色結果顯示，43例涎腺惡性腫瘤的VM陽性率為18.6%（8/43），其中5例腺樣囊性癌VM陽性，1例黏液表皮樣癌VM陽性，1例多形性腺瘤VM陽性，1例肌上皮癌VM陽性。5例正常腺體組織的VM陽性率為0%（0/5）。兩種組織標本的VM陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 涎腺惡性腫瘤中血管生成與擬血管生成的相關性分析

多變量相關分析結果顯示，涎腺惡性腫瘤組織中VM的數量與血管數量呈正相關（r=0.548，P＜0.01）。

2.4 腺樣囊性癌中VM與病理分型的關系

33例腺樣囊性癌中，實質型12例，腺樣-管狀型21例（管狀型10例，腺樣型11例）；其中腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織中VM陽性率為4.8%（1/21），實質型腺樣囊性癌組織中VM陽性率為33.3%（4/12），實質型腺樣囊性癌組織中VM陽性率高于腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 腺樣囊性癌中VM與MVD的關系

33例腺樣囊性癌標本中，5例VM陽性，28例VM陰性；VM陽性腺樣囊性癌中MVD為（35.09±14.40），高于VM陰性腺樣囊性癌的（24.63±20.63），但差異無統(tǒng)計學意義（t=1.081，P＞0.05）。

3 討論

血管生成擬態(tài)是指由具有可塑性、侵襲性的腫瘤細胞構成的，而無內皮細胞參與條件下細胞外基質界限的管腔結構。腫瘤生長相關理論提出腫瘤的生長與轉移依賴于新血管的形成，從而使腫瘤獲得豐富的營養(yǎng)物質和氧，減少其中心壞死的出現，更利于腫瘤的生長。由于VM無內皮細胞襯里，存在一層PAS陽性基底膜結構，腫瘤細胞可與血液直接接觸，因此腫瘤細胞可獲得更豐富的營養(yǎng)和氧[9]。由于VM結構缺少內皮屏障，構成VM管壁結構的腫瘤細胞脫落后可直接進入血流，為腫瘤的遠處轉移提供了有利條件。大量研究表明，VM僅存在于一些高侵襲性的惡性腫瘤中，如腎透明細胞癌、乳腺導管癌等[10-11]。因此VM存在與否與腫瘤的轉移及預后密切相關。

本研究通過СD31+PAS雙重染色對涎腺惡性腫瘤組織進行染色，結果發(fā)現涎腺惡性腫瘤組織中存在VM結構，而正常腺體組織中無VM結構。光鏡下對VM結構進行觀察，發(fā)現VM結構是由腫瘤細胞構成的非內皮細胞襯附的管道或網狀結構。在VM管腔中，PAS陽性物質將腫瘤細胞與管腔中的血流分隔開，部分標本中可見PAS陽性物質填充部分管腔；本研究還發(fā)現，在涎腺惡性腫瘤中存在PAS陽性網絡結構，該結構呈條索狀，內無管腔，可見部分條索結構可與內皮依賴性血管相接。本研究結果與Maniotis等[2]研究發(fā)現的典型的擬血管結構是由腫瘤細胞構成，管壁無內皮細胞，管腔內有紅細胞存在相符合。構成管腔的腫瘤細胞間及腫瘤細胞與紅細胞間均無СD31染色陽性物質存在，表明無內皮細胞參與此管道的構建。在紅細胞和腫瘤細胞之間有PAS陽性物質間隔，也有部分管腔中有PAS染色陽性物質填充。VM是由腫瘤細胞擬血管生成的一種具有血管功能的血管通路。本研究結果顯示，43例涎腺惡性腫瘤組織中，有部分VM結構可與內皮性血管相連，腫瘤組織通過VM與宿主血管相連通，從而為腫瘤組織的生長、浸潤和轉移提供足夠的血液供應；涎腺惡性腫瘤組織與正常腺體組織中VM的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；本研究還對涎腺惡性腫瘤血管與VM數量之間關聯性進行分析，結果顯示涎腺惡性腫瘤組織中VM的數量與血管數量呈正相關（P＜0.01）。

腺樣囊性癌是涎腺惡性腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，是一種侵襲性很強的腫瘤，通過黏膜下及纖維組織向腫瘤周圍播散，同時有沿神經擴散[12-13]。涎腺腺樣囊性癌遠處轉移率較高，常見的轉移部位為肺[14-15]。本研究根據病理類型不同，對33例涎腺腺樣囊性癌組織中VM的陽性情況進行分析，結果顯示實質型腺樣囊性癌組織中VM陽性率高于腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示涎腺惡性腫瘤的惡性程度越高或侵襲行為越強的病理分型VM陽性率越高，侵襲行為越強或惡性程度越高的惡性腫瘤細胞本身基因表型越復雜，腫瘤細胞的可塑性越強，同時腫瘤生長速度越快，均可導致腫瘤局部缺氧壓力越高，越促進VM的形成。

Folberg等[16]研究發(fā)現，PAS染色陽性物質圖案狀分布的特點與葡萄膜黑色素瘤的預后密切相關。Fan等[17]研究發(fā)現，原發(fā)性膽囊癌的預后更差，VM生成是原發(fā)性膽囊癌患者的獨立預后因素之一。目前組織活檢病理學檢查等技術可以用于發(fā)現有無VM形成[18]。若術前能夠充分了解腫瘤供血系統(tǒng)的結構，便可以對腫瘤的具體情況做出更準確地評估，從而選擇更為適合的治療方式，對于手術范圍的確定可更為合理。減少了手術中由于手術范圍過小腫瘤術后短期復發(fā)、轉移或手術范圍過大影響患者術后的生存質量。VM具有一定的可塑性，在光鏡下形成VM管壁的腫瘤細胞與內皮性血管的內皮細胞相似，采用一般的組織病理學方法難以將兩者區(qū)分開，為了更有效地提高VM的檢出率，采用СD31+PAS雙重染色來檢測VM，并證明該方法是可行的、經濟的。VM的檢測對于判斷涎腺惡性腫瘤的預后具有一定的意義。然而腫瘤的血液供應途徑相當復雜，因此臨床上如果能結合不同血管的表達情況對涎腺惡性腫瘤的預后進行評估則會更為準確。如何更有效的、定量并綜合分析VM與涎腺惡性腫瘤侵襲、轉移、預后之間的相關性，還需要進一步深入研究。

綜上所述，涎腺惡性腫瘤中VM的存在對患者的預后提出了巨大的挑戰(zhàn)，為抗血管治療提供了新的靶點。