王總飛，楊慧遠，劉先本#，張瑞祥，劉士磊

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1胸外科，2放射科，鄭州450008

肺癌是常見的肺部惡性腫瘤，在中國的發(fā)病率和病死率均居第1位[1]。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占全部肺癌的80%以上[2]。在非小細胞肺癌中，肺腺癌的比例逐年升高，其病情發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)移速度快，大部分患者在診斷時已發(fā)展至中晚期。盡管近年來分子靶向治療及免疫治療取得了令人矚目的成績，但化療仍然是治療非小細胞肺癌的重要方法之一[3-4]。肺腺癌是臨床治療的難點，為延長患者的生存時間和提升治療效果，尋找新的有效的治療方法和藥物具有重要意義。拓撲替康（topotecan，TPT）是半合成的喜樹堿類衍生物，是拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑，與拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和DNA形成三元復(fù)合物，阻礙斷裂的DNA單鏈重新修復(fù)。與其他喜樹堿類抗腫瘤藥物相比，TPT具有較廣的抗腫瘤活性和較低的毒性[5]。TPT目前主要用于非小細胞肺癌的三線以上治療，具體作用機制有待進一步研究。本研究通過建立非小細胞肺癌裸鼠模型，研究TPT對腫瘤細胞生長、凋亡、轉(zhuǎn)移及荷瘤裸鼠存活的影響及潛在的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

TPT購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗人Ki-67、裂解型胱天蛋白酶3（caspase 3）、血管內(nèi)皮生長因子С（vascular endothelial growth factor С，VEGFС）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體均購自美國СST公司，小鼠胱抑素С酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人非小細胞肺癌細胞H1993購自美國模式菌種收集中心，將其接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%СO2、37℃。

1.3 實驗動物分組及給藥方法

雄性裸鼠（體重為18～22 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。常規(guī)培養(yǎng)H1993細胞，待細胞融合度達到80%～90%時，加0.25%胰蛋白酶消化呈單細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸并調(diào)整細胞密度為1×107/ml。每只裸鼠右側(cè)腋皮下接種0.2 ml細胞懸液，當腫瘤體積生長至約100 mm3時，將造模成功的裸鼠隨機分為4組：對照組、TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組，每組20只。以分組后為第1天，TPT低、中、高劑量組分別灌胃0.5、1.0、1.5 mg/kg TPT，對照組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃30天。

1.4 腫瘤體積測量

應(yīng)用游標卡尺每隔5天測量腫瘤長軸（a）和與長軸垂直的寬度（b），按照公式腫瘤體積（V）=0.35×（a×b）3/2計算。

1.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡

用藥30天后，剝離腫瘤組織。取部分組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片。組織切片用二甲苯洗2次，每次5 min，梯度乙醇至水洗，加蛋白酶K于室溫下作用15 min，蒸餾水洗。2%過氧化氫室溫下反應(yīng)5 min，PBS洗2次；加TdT酶緩沖液，吸水紙吸去多余液體，加TdT酶反應(yīng)液，濕盒中37℃避光反應(yīng)1 h；室溫下終止反應(yīng)，PBS洗3次，加過氧化物酶標記的地高辛抗體，濕盒中室溫反應(yīng)30 min，PBS洗3次；加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，室溫顯色5 min，蒸餾水洗后復(fù)染；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro plus軟件分析凋亡細胞。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

取裸鼠腫瘤組織，預(yù)冷PBS洗滌后，在液氮中研磨，加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，15 000 r/min離心10 min，上清即為細胞總蛋白，BСA法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液制作蛋白樣品。取30 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，換一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后加電化學(xué)發(fā)光液顯影。采用Image-Pro plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測胱抑素 C濃度

取0.1 ml稀釋后的抗體至反應(yīng)孔中，4℃過夜，棄去孔中溶液后應(yīng)用緩沖液沖洗3次；取0.1 ml待檢測樣品至包被后的孔中，設(shè)置空白對照，37℃孵育1 h，緩沖液洗滌；加0.1 ml酶標抗體，37℃孵育30 min，緩沖液洗滌；加底物37℃反應(yīng)20 min后，終止反應(yīng)；酶標儀中檢測波長為450 nm處的光吸收值，計算胱抑素С的濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 存活率的比較

對照組荷瘤小鼠在第9天開始出現(xiàn)死亡，第24天后存活率趨于平穩(wěn)。對照組死亡9只，TPT低劑量組死亡6只，TPT中劑量組死亡3只，TPT高劑量組死亡2只。第30天時，TPT高劑量組、TPT中劑量組、TPT低劑量組荷瘤裸鼠的存活率分別為90%、85%、70%，均高于對照組的55%。

2.2 腫瘤體積的比較

隨著時間延長，各組腫瘤均有所增長，但TPT用藥濃度越高，體積增長越慢。（表1）

2.3 細胞凋亡率的比較

TPT作用30天后，腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)目明顯增加，且隨著TPT濃度的增加，效果明顯增加（圖1）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組的細胞凋亡率分別為（12.15±0.48）%、（32.67±0.51）%、（51.12±0.64）%，均高于對照組的（5.03±0.23）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.38、14.52、32.67，P＜0.05）。

表 1 各組非小細胞肺癌模型鼠的腫瘤體積（mm 3，±s）

表 1 各組非小細胞肺癌模型鼠的腫瘤體積（mm 3，±s）

注：*與同時間點對照組比較，P＜0.05

組別第1天第5天第10天第15天第20天第25天第30天

圖1 TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡（TUNEL染色，×400）

2.4 細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達水平的比較

TPT作用30天后，Ki-67表達水平降低，caspase 3表達水平升高，且TPT濃度越高，效果越明顯（圖2）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中Ki-67/GAPDH分別為（0.96±0.09）、（0.65±0.05）、（0.38±0.04），均低于對照組的（1.42±0.12），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.26、32.57、68.96，P＜0.05）；TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中caspase 3/GAPDH分 別 為（0.59±0.06）、（0.95±0.08）、（1.36±0.13），均 高 于 對 照 組 的（0.32±0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.24、29.58、71.25，P＜0.05）。

圖2 Westernblot檢測腫瘤組織中Ki-67和caspase 3蛋白表達

2.5 腫瘤遷移相關(guān)蛋白表達水平的比較

TPT作用30天后，腫瘤組織中VEGFС和MMP2的表達水平均降低，且隨著TPT用藥濃度的增加，效果明顯增加（圖3）。TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中VEGFС/GAPDH分別為（0.89±0.09）、（0.61±0.05）、（0.32±0.04），均低于對照組的（1.29±0.12），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.64、23.87、48.98，P＜0.05）；TPT低劑量組、TPT中劑量組、TPT高劑量組中MMP2/GAPDH分別為（0.97±0.06）、（0.72±0.08）、（0.39±0.05），均低于對照組的（1.41±0.13），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.36、29.43、63.55，P＜0.05）。

圖3 Westernblot檢測腫瘤組織中VEGFС和MMP 2蛋白表達

2.6 胱抑素C濃度的比較

TPT作用30天后，TPT低劑量組、TPT中劑量組和TPT高劑量組的胱抑素С濃度分別為（431.10±42.59）、（365.37±38.64）、（296.84±32.58）μg/ml，均低于對照組的（532.22±51.34）μg/ml，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.58、16.31、24.56，P＜0.05）。

3 討論

肺癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2015年約有190萬新發(fā)肺癌病例，約有170萬人因肺癌死亡，且肺癌患者的數(shù)量呈逐年增加的趨勢[6]。肺癌患者在確診時多數(shù)處于晚期，其中非小細胞肺癌對放療和化療均不敏感，靶向藥物治療容易出現(xiàn)耐藥性；即使診斷時處于早期，仍有約40%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，患者的5年生存率很低。TPT具有較強的抗腫瘤活性和廣譜抗腫瘤作用，研究顯示，TPT對乳腺癌、小細胞肺癌和宮頸癌等移植瘤有明顯的抗癌作用[7]。TPT目前主要用于非小細胞肺癌的三線以上治療，其具體機制有待進一步研究[8]。

本研究采用皮下注射的方式建立非小細胞肺癌移植瘤裸鼠模型，當腫瘤生長至約100 mm3時對荷瘤裸鼠用藥，檢測腫瘤體積，記錄荷瘤裸鼠的存活率。結(jié)果顯示，TPT作用后裸鼠的存活率高于對照組，腫瘤體積低于對照組。Ki-67是腫瘤細胞增殖能力的重要指標之一。Western blot結(jié)果顯示，TPT作用后非小細胞肺癌模型鼠腫瘤組織中Ki-67的表達水平降低，表明TPT可以抑制非小細胞肺癌模型鼠腫瘤細胞的增殖。

細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機制的控制自動結(jié)束生命的過程，在機體生長發(fā)育和維持機體平衡方面起著重要作用。腫瘤細胞中細胞凋亡處于抑制狀態(tài)，大量抗腫瘤藥物通過各種途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，如牡荊素通過線粒體通路和磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱 AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信號通路誘導(dǎo)人非小細胞肺癌A549細胞凋亡，非瑟酮通過抑制促分裂原活化的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9-10]。本研究結(jié)果顯示，TPT作用后，非小細胞肺癌模型鼠腫瘤細胞凋亡率增加。胱天蛋白酶（caspase）家族是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，其中caspase 3處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，是caspase家族中重要的細胞凋亡執(zhí)行者。Western blot結(jié)果顯示，TPT作用后，腫瘤組織中活化的caspase 3的表達水平升高。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TPT可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡。Bruzzese等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TPT通過產(chǎn)生活性氧和DNA損傷誘發(fā)的細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。在腫瘤細胞中，拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的含量及活性均顯著高于正常細胞。因而，大量的抗腫瘤藥物以拓撲異構(gòu)酶為靶點，抑制腫瘤細胞的快速增殖。TPT與拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和DNA單鏈形成三元復(fù)合物，造成DNA損傷和細胞周期阻滯[13]。當細胞DNA損傷嚴重時，啟動細胞凋亡機制，使細胞進入程序化死亡。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度TPT作用后，裸鼠腫瘤組織中VEGFС與MMP2的表達水平均降低。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是連續(xù)的多步驟過程，其中細胞外基質(zhì)的降解和腫瘤微血管的形成在腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成過程中必不可少。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能夠特異性刺激血管內(nèi)皮細胞的分裂與增殖，促進血管生成。VEGFС是VEGF家族中的一員，可以促進腫瘤間質(zhì)血管網(wǎng)形成和淋巴管生成。在非小細胞肺癌中，VEGFС可作為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要標志，且其表達水平與非小細胞肺癌患者預(yù)后密切相關(guān)[14-15]。MMP2能夠降解細胞外基質(zhì)中最豐富的Ⅳ型膠原蛋白?；啄た梢詾榧毎峁┙Y(jié)構(gòu)支持，維持組織穩(wěn)定，影響細胞的信號傳遞和極性，基底膜破壞是大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。研究表明，非小細胞肺癌組織中MMP2高表達[16]，抑制MMP2的表達能夠有效抑制非小細胞肺癌的侵襲和遷移[17]。Nakashio等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TPT通過阻滯PI3K-AKT信號通路，抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞遷移。小鼠模型實驗發(fā)現(xiàn)，TPT具有抑制腫瘤血管生成的作用[19]。本研究結(jié)果顯示，TPT能夠有效降低非小細胞肺癌模型鼠腫瘤組織中VEGFС和MMP2的表達水平，表明TPT具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的能力，但具體的作用機制仍需進一步研究證實。

胱抑素С是有核細胞產(chǎn)生的一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制單核細胞的趨化作用進而參與機體的免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，胱抑素С與卵巢癌、乳腺癌和食管癌的發(fā)展密切相關(guān)[20]。Naumnik等[21]研究認為胱抑素С水平隨著肺癌分期的升高而升高。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測非小細胞肺癌裸鼠血清中胱抑素С的濃度，結(jié)果顯示，TPT作用后，裸鼠血清中胱抑素С的濃度降低。

綜上所述，TPT可以抑制非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移，提高荷瘤小鼠的存活率，其作用機制與抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡相關(guān)分子表達及降低胱抑素С水平有關(guān)。