張志洋 高滿海 趙志英 姜寒薇 李慧君 武建斌

(包頭醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000；2麻醉學(xué)院；3 2015 級(jí)麻醉專業(yè)本科生)

缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷是休克、肺移植、單側(cè)肺通氣及體外循環(huán)術(shù)后肺功能障礙的重要因素，及時(shí)合理防治對(duì)減少肺缺血再灌注損傷(LIRI)具有重要臨床意義。戊乙奎醚作為一種高選擇抗膽堿能藥物，已廣泛用于麻醉前用藥、有機(jī)磷農(nóng)藥中毒搶救及改善微循環(huán)等方面。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，戊乙奎醚在預(yù)防和治療急性肺損傷中有良好的保護(hù)作用〔1〕，其通過(guò)抑制血清中高遷移率族蛋白(HMG)B1、肺表面活性蛋白(SP)-A的表達(dá)，增加支氣管腫泡灌洗液(BALF)中SP-A的表達(dá)，對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷具有顯著療效〔2〕。但關(guān)于戊乙奎醚預(yù)處理對(duì)LIRI的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬用Wistar大鼠建立LIRI模型，探究戊乙奎醚對(duì)LIRI的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑 健康Wistar雄性大鼠120只，體重250～300 g，購(gòu)于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。鹽酸戊乙奎醚注射液批號(hào)：20090511-1，購(gòu)自成都力思特制藥股份有限公司。

1.2動(dòng)物分組和模型制備 將120只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、LIRI模型組(LIRI組)、戊乙奎醚低劑量組及高劑量組(P1組及P2組)每組30只。4組均采用1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，參照廖秀清等〔3〕建立的LIRI模型，左側(cè)第5肋間開(kāi)胸，于呼氣末以無(wú)損傷血管鉗夾閉左肺門(mén)，缺血45 min后開(kāi)放灌注2 h；S組僅游離肺門(mén)，但不夾閉；P1、P2組分別于術(shù)前1 h靜脈注射戊乙奎醚0.3 mg/kg和1.0 mg/kg，S組與LIRI組分別給予等容量的生理鹽水。

1.3肺組織濕干質(zhì)量比 (W/D) 取左肺組織，濾紙吸凈表面液體，天平稱其濕重后，置于70℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)，48 h后稱其干重，計(jì)算W/D。

1.4肺組織病理學(xué)觀察 取左肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.5Western印跡法檢測(cè)各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達(dá) 將各組肺組織加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液。用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20 μg/孔)。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，以β-肌動(dòng)蛋白(Actin)為內(nèi)參，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)量的半定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理學(xué)觀察 顯微鏡下可見(jiàn)S組肺組織結(jié)構(gòu)清晰；LIRI組肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)充血水腫，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，肺部損傷最嚴(yán)重；P1、P2組肺組織結(jié)構(gòu)、肺泡間隔及肺間質(zhì)充血水腫情況較LIRI組減輕，同時(shí)P1組較P2組肺組織損傷輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織病理學(xué)比較(HE，×100)

2.2各組W/D比較 與S組比較，LIRI組、P1組、P2組W/D顯著升高(P<0.05)；與LIRI組比較，P1組、P2組W/D顯著降低，且P2組顯著低于P1組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達(dá)比較 與S組比較，LIRI組、P1組、P2組肺組織中HMGB1表達(dá)顯著升高，SP-A表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與LIRI組比較，P1組、P2組HMGB1表達(dá)顯著降低，SP-A表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且P2組HMGB1表達(dá)降低和SP-A表達(dá)升高較P1組更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

表1 各組肺組織W/D值、HMGB1、SP-A 表達(dá)比較

與S組比較：1)P<0.05；與LIRI組比較：2)P<0.05；與P1組比較：3)P<0.05

圖2 各組肺組織中HMGB1、SP-A蛋白表達(dá)

3 討 論

LIRI是影響術(shù)后早期肺功能恢復(fù)的關(guān)鍵性因素，其主要特征是發(fā)生局部和全身的炎癥反應(yīng)，此類反應(yīng)可引起多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡〔4〕。

SP-A在促使肺泡炎癥消退、抑制AT-Ⅱ的凋亡及降低肺泡表面張力等方面具有重要作用，可預(yù)防肺泡萎陷和肺不張〔5，6〕，當(dāng)肺發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)會(huì)使得該蛋白含量減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與吳畏等〔7〕的研究結(jié)果吻合，即當(dāng)肺發(fā)生急性損傷時(shí)，可出現(xiàn)SP-A蛋白表達(dá)下調(diào)，加劇肺部炎癥反應(yīng)，使肺損傷進(jìn)一步惡化。HMGB1作為重要的晚期炎癥因子與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)〔8〕，加重肺泡-毛細(xì)血管屏障的損傷，細(xì)胞膜通透性增加，SP-A進(jìn)入血液循環(huán)，肺組織中SP-A含量進(jìn)一步下降。本研究結(jié)果提示LIRI可能激活了HMGB1-RAGE信號(hào)通路，引起HMGB1的過(guò)表達(dá)，加劇了肺部炎癥反應(yīng)。Kao等〔9〕、陸建峰等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)急性肺損傷大鼠應(yīng)用HMGB1抑制劑治療，可抑制HMGB1蛋白表達(dá)上調(diào)，從而減輕炎癥細(xì)胞的聚集和肺水腫，對(duì)肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。戊乙奎醚作為新型抗膽堿藥，廣泛用于器官缺血再灌注損傷的保護(hù)，選擇作用于M1、M3受體，對(duì)肺的保護(hù)機(jī)制除解除支氣管平滑肌痙攣外，還可提高肺組織對(duì)缺血缺氧的耐受性，降低肺毛細(xì)血管通透性，改善微循環(huán)；抑制肺部炎癥反應(yīng)，從而減輕肺水腫并改善通氣〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明戊乙奎醚對(duì)LIRI大鼠肺組織起到保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，肺發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)可能伴隨HMGB1-RAGE信號(hào)通路的激活及HMGB1蛋白的過(guò)表達(dá)。其中，HMGB1-RAGE信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，HMGB1與RAGE結(jié)合后使得下游P38MAPK磷酸化和核因子(NF)-κB活化，誘導(dǎo)炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生炎癥效應(yīng)和免疫應(yīng)答，導(dǎo)致缺血再灌注損傷的發(fā)生〔13〕。本研究證明戊乙奎醚有助于減輕LIRI。同時(shí)，戊乙奎醚可能阻斷了HMGB1-RAGE信號(hào)通路，抑制HMGB1的過(guò)表達(dá)，阻止因炎癥因子HMGB1的大量產(chǎn)生和聚集引起的炎癥瀑布效應(yīng)，有利于減輕肺部炎癥反應(yīng)，且戊乙奎醚高劑量組對(duì)肺損傷的改善效果優(yōu)于低劑量組。

綜上，戊乙奎醚能夠抑制LIRI時(shí)HMGB1-RAGE信號(hào)通路的激活，增加肺組織中SP-A的表達(dá)，對(duì)缺血再灌注損傷的肺組織起保護(hù)作用。