彭 程，黎金雨，趙 云，余 莉

(1. 四川省廣安市人民醫(yī)院兒科，四川 廣安 638000； 2. 四川省遂寧市第一人民醫(yī)院兒科，四川 遂寧 629000； 3. 成都兒童?？漆t(yī)院兒科，四川 成都 610015； 4. 四川大學華西第二醫(yī)院兒科，四川 成都 610041)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是小兒毛細支氣管炎最常見的病原體，RSV感染患兒較副流感病毒、肺炎支原體等非RSV感染患兒的預后差，目前尚無有效的預防和治療措施。RSV感染后炎癥調(diào)節(jié)紊亂是影響病毒清除與疾病病程的重要原因，主要表現(xiàn)為炎癥細胞的不斷浸潤以及細胞因子的大量分泌，在發(fā)揮抗病毒作用的同時，也會導致嚴重的肺損傷[1]。因此，深入探討RSV感染后炎癥紊亂的病理機制具有重要的臨床意義。

髓系細胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)可以與下游接頭分子DNAX活化蛋白12(DNAX-activating protein 12，DAP12)相互作用，激活炎癥信號通路[2-4]。TREM-1在不同種類微生物感染中可能發(fā)揮不同作用，如在流感病毒感染模型中TREM-1基因缺失可降低炎癥水平[5]；在銅綠假單胞菌感染中發(fā)現(xiàn)TREM-1基因缺失可促進炎癥因子分泌[6]。但是，TREM-1在RSV毛細支氣管炎患兒中的表達及作用目前尚無報道，因此，本文旨在探討TREM-1、DAP12在RSV毛細支氣管炎患兒中的表達，并構建RSV感染人支氣管上皮(normal human bronchial epithelial cells，NHBE)細胞模型，以深入研究相關機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年1月四川省廣安市人民醫(yī)院RSV毛細支氣管炎患兒為病例組，共67例。納入標準：(1)年齡≤2歲；(2)符合《毛細支氣管炎診斷、治療與預防專家共識(2014年版)》中的診斷標準[7]；(3)采用鼻咽拭子采集呼吸道分泌物，病原學檢查為RSV單一感染；(4)入院前1個月內(nèi)未經(jīng)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療；(5)入院前病程在3 d內(nèi)。排除標準：合并肺結核、免疫缺陷病、先天性疾病等。

根據(jù)入院lowell評分，將病例組分為輕癥組(臨床評分≤9分，共39例)和重癥組(臨床評分≥10分，共28例)。選取同期體檢的健康兒童作為對照組，共35例。本研究已獲四川省廣安市人民醫(yī)院倫理委員會的批準，且研究對象監(jiān)護人均已簽署知情同意書。

1.2 血清中炎癥因子含量的檢測 治療前，經(jīng)肘正中靜脈穿刺采集靜脈血0.5 mL，分離血清，分裝后保存于-80℃冰箱。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)檢測血清中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)含量。

1.3 外周血單個核細胞中TREM-1、DAP12 mRNA的檢測 治療前，經(jīng)肘正中靜脈穿刺采集EDTA抗凝靜脈血2 mL，使用人外周血單個核細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA表達量。以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列為：TREM-1上游引物，5’-GAACTCCGAGCTGCAACTAAA-3’；下游引物，5’-TCTAGCGTGTAGTCACATTTCAC-3’。DAP12上游引物，5’-GAGACCGAGTCGCCTTATCA-3’；下游引物，5’-GTCATGATTCGGGCTCATTT-3’。

1.4 PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白質(zhì)的檢測 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測PBMCs中TREM-1、DAP12蛋白質(zhì)表達量。常規(guī)進行蛋白提取、電泳、轉(zhuǎn)印等步驟，一抗(英國Abcam公司)稀釋比例為：TREM-1(1∶1 000)、DAP12(1∶500)、GAPDH(1∶3 000)。上述試驗均在四川省廣安市人民醫(yī)院完成。

1.5 細胞學試驗

1.5.1 主要試劑 NHBE細胞、人喉癌上皮細胞(Hep-2細胞)均購自美國ATCC；RSV病毒(A亞型)購自廣州博特生物工程有限責任公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectin-2000TM購自美國Invitrogen公司。

1.5.2 細胞與病毒培養(yǎng) NHBE細胞、Hep-2細胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。將RSV病毒接種至Hep-2細胞，培養(yǎng)3～5 d后收集細胞，反復凍融獲取病毒懸液，根據(jù)Reed-muench法測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)。細胞學試驗均于四川大學華西第二醫(yī)院完成。

1.5.3 RSV感染 將NHBE細胞接種于6孔板，待匯合度達到80%左右時，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，依次加入滴度為0、50、100、500 TCID50的RSV病毒懸液，放置于37℃培養(yǎng)箱中吸附2 h，棄去上層懸液，PBS洗滌2次，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細胞，WB檢測不同滴度RSV誘導時NHBE細胞中TREM-1蛋白質(zhì)的表達。此外，在滴度為100 TCID50的誘導條件下，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，然后收集細胞，WB檢測不同誘導時間NHBE細胞中TREM-1蛋白質(zhì)的表達。

1.5.4 RNA干擾質(zhì)粒的構建與轉(zhuǎn)染 參照文獻[8]報道，設計針對人TREM-1的siRNA序列，具體序列為：siRNA-TREM-1正義鏈，5’-CCGGTG GCAGATAATAAGGGACGGCTCGAGCCGTCC CTTATTATCTGCCTTTTTG-3’；siRNA-TREM-1反義鏈，5’-AATTCAAAAAGGCAGATAATA AGGGACGGCTCGAGCCGTCCCTTATTATCT GCCA-3’。siRNA-Control正義鏈，5’-CCGGTGG GAAGTACGGAGTAAACGCTCGAGCGTTTA CTCCGTACTTCCCTTTTTG-3’；siRNA-Control反義鏈，5’-AATTCAAAAAGGGAAGTACG GAGTAAACGCTCGAGCGTTTACTCCGTACT TCCCA-3’。將上述寡核苷酸單鏈退火后，克隆至pGenesil-1.1質(zhì)粒。使用Lipofectin-2000TM將測序正確的siRNA-Control質(zhì)粒和siRNA-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NHBE細胞。

1.5.5 試驗分組 細胞學試驗分為4組：對照組、RSV感染組、RSV+siRNA-Control組、RSV+siRNA-TREM-1組。對照組、RSV感染組使用未進行轉(zhuǎn)染的NHBE細胞，RSV+siRNA-Control組和RSV+siRNA-TREM-1組分別使用siRNA-Control質(zhì)粒和siRNA-TREM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NHBE細胞。對照組不進行RSV感染，其余3組均使用滴度為100 TCID50的RSV感染，誘導時間為48 h。

1.5.6 檢測指標 RSV感染48 h后，收集各組細胞及上清液，使用qRT-PCR檢測各組細胞中TREM-1、DAP12 mRNA表達，使用WB檢測各組細胞中TREM-1、DAP12蛋白表達水平，使用ELISA檢測細胞上清液中炎癥因子的含量，包括IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1。

使用免疫熒光染色檢測各組細胞中TREM-1蛋白表達水平，具體步驟為：4%多聚甲醛固定30 min，封閉1 h，滴加抗TREM-1抗體(1∶50)4℃過夜。二抗孵育、DAPI染色、封片等步驟后拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有計量資料均采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基本資料 病例組共67例RSV毛細支氣管炎患兒，其中輕癥組39例，重癥組28例。輕癥組中男性21例，女性18例，平均年齡(9.16±4.22)個月；重癥組中男性13例，女性15例，平均年齡(9.45±4.63)個月。對照組共35例健康兒童，其中男性18例，女性17例，平均年齡(9.28±4.06)個月。三組兒童性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.2 各組兒童血清中炎癥因子含量的比較 輕癥組和重癥組兒童血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于對照組，且重癥組IL-1β、IL-8、IL-17、HMGB1含量高于輕癥組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.3 各組兒童PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA及其蛋白的表達變化 輕癥組和重癥組兒童PBMCs中TREM-1、DAP12 mRNA及蛋白表達量均高于對照組，且重癥組高于輕癥組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見圖1、圖2。

2.4 RSV誘導NHBE細胞表達TREM-1蛋白情況 隨著RSV濃度和誘導時間的增加，NHBE細胞中TREM-1的表達量逐漸升高，RSV濃度為100 TCID50以及誘導時間為48 h時，TREM-1的表達量達到最高。見圖3。

表1 各組兒童血清中炎癥因子含量的比較(pg/mL)

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與輕癥組比較，P<0.05。

A：qRT-PCR檢測TREM-1 mRNA表達；B、C：WB檢測TREM-1蛋白表達。1：對照組；2：輕癥組；3：重癥組。a：與對照組比較，P<0.05；b：與輕癥組比較，P<0.05。

圖1 各組PBMCs中TREM-1 mRNA和蛋白表達水平

Figure 1 Expression level of TREM-1 mRNA and protein in PBMCs of each group

A：qRT-PCR檢測DAP12 mRNA表達；B、C：WB檢測DAP12蛋白表達。1：對照組，2：輕癥組，3：重癥組。a：與對照組比較，P<0.05；b：與輕癥組比較，P<0.05。

圖2 各組PBMCs中DAP12 mRNA和蛋白表達水平

Figure 2 Expression level of DAP12 mRNA and protein in PBMCs of each group

A：WB檢測不同感染滴度下TREM-1的蛋白表達；B：WB檢測不同感染時間下TREM-1的蛋白表達。a：與0 TCID50(或0 h)比較，P<0.05；b：與50 TCID50(或24 h)比較，P<0.05。

圖3 RSV誘導NHBE細胞表達TREM-1蛋白水平

Figure 3 Expression level of TREM-1 protein in NHBE cells induced by RSV

2.5 TREM-1沉默對TREM-1表達的抑制效果 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組中TREM-1 mRNA和蛋白量均高于對照組和RSV+siRNA-TREM-1組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。RSV感染組、RSV+siRNA-Control組的熒光強度強于對照組和RSV+siRNA-TREM-1組，見圖5。

A：qRT-PCR檢測TREM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；B、C：WB檢測TREM-1蛋白表達。1：對照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。a：與對照組比較，P<0.05；b：與RSV感染組比較，P<0.05；c：與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

圖4 各組NHBE細胞中TREM-1 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平

Figure 4 Expression level of TREM-1 mRNA transcription and protein in NHBE cells of each group

1：對照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。

圖5 免疫熒光染色檢測各組NHBE細胞中TREM-1表達情況

Figure 5 Expression of TREM-1 in NHBE cells by immunofluorescence staining of each group

2.6 TREM-1沉默對DAP12表達的影響 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組中DAP12 mRNA和蛋白表達量均高于對照組和RSV+siRNA-TREM-1組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。 RSV+siRNA-TREM-1組中DAP12 mRNA和蛋白表達量高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

2.7 TREM-1沉默對炎癥因子分泌的影響 RSV感染組、RSV+siRNA-Control組細胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。RSV+siRNA-TREM-1組的上述炎癥因子含量均低于RSV感染組、RSV+siRNA-Control組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。RSV+siRNA-TREM-1組的IL-8、IL-17、HMGB1炎癥因子含量高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

A：qRT-PCR檢測DAP12 mRNA表達；B、C：WB檢測DAP12蛋白表達。1：對照組；2：RSV感染組；3：RSV+siRNA-Control組；4：RSV+siRNA-TREM-1組。a：與對照組比較，P<0.05；b：與RSV感染組比較，P<0.05；c：與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

圖6 各組NHBE中DAP12 mRNA和蛋白表達水平

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與RSV感染組比較，P<0.05；c表示與RSV+siRNA-Control組比較，P<0.05。

3 討論

TREM-1是Bouchon等人于2000年首次發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白，是炎癥級聯(lián)反應中的重要調(diào)節(jié)因子。盡管目前尚未明確鑒定出TREM-1配體，但間接證據(jù)表明損傷相關分子模式(DAMPs)和病原相關分子模式(PAMPs)可活化TREM-1，從而誘導炎癥因子分泌[9]。此外，TREM-1其他功能的發(fā)現(xiàn)，如促進T細胞增殖，激活抗原呈遞細胞，表明TREM-1蛋白在調(diào)節(jié)宿主對病原微生物的免疫反應中發(fā)揮更重要的作用[10]。

最初研究[11]認為TREM-1主要表達于巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等免疫細胞表面，僅在膿毒癥等細菌感染疾病中發(fā)揮免疫效應。但近年研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，TREM-1也表達于氣道上皮細胞、軟骨細胞等組織細胞表面，參與病毒感染以及無菌性炎癥。Yuan等[14]在研究人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)在巨噬細胞中的隱匿機制時發(fā)現(xiàn)，HIV可通過NFκB信號通路誘導巨噬細胞高表達TREM-1，增強其抗凋亡能力，而沉默TREM-1表達則可上調(diào)Caspase 3表達，下調(diào)Bcl-2表達，促進巨噬細胞凋亡，認為靶向沉默TREM-1可能提高HIV的清除率。然而，TREM-1在其他種類病毒感染中的作用仍知之甚少，在RSV毛細支氣管炎患兒中的表達情況及作用機制尚無報道。

炎癥因子的大量釋放是RSV感染與機體免疫屏障相互作用的結果，也是加重肺部病理損傷的原因之一，血清中炎癥因子含量與患兒預后密切相關[15]。因此，本文首先對RSV毛細支氣管炎患兒血清中炎癥因子含量進行檢測，ELISA法檢測結果表明RSV毛細支氣管炎患兒血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、HMGB1含量均顯著升高，而且與病情程度有關。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)TREM-1 mRNA和蛋白在PBMCs中的表達量也顯著升高，與炎癥因子的升高趨勢一致，提示TREM-1可能參與RSV致炎機制。TREM-1的胞漿結構域缺乏信號基序，其功能效應主要依賴于下游接頭分子DAP12傳遞[16]，因此，TREM-1與DAP12的表達趨勢常保持一致，本文研究結果顯示，DAP12 mRNA和蛋白在PBMCs中高表達，也證實了上述結論。TREM-1/DAP12信號通路介導炎癥因子釋放的因果關系并不恒定，兩者可能相互作用，共同誘導炎癥級聯(lián)擴大。部分研究結果可間接支持這一結論，例如：HMGB1可能是TREM-1的配體[17]；NFκB不僅是TREM-1/DAP12誘導炎癥因子釋放的下游信號通路，也可上調(diào)TREM-1表達，沉默NF-κB p65可抑制HIV相關蛋白Tat或者gp120對TREM-1表達的誘導作用[14]。

為了進一步證實上述結論，本文構建了RSV感染NHBE的體外細胞模型，結果發(fā)現(xiàn)RSV可通過濃度和時間依賴的方式誘導TREM-1高表達。以往研究大多認為，TREM-1主要通過炎癥細胞發(fā)揮生物學效應，如增強細胞遷移能力，促進炎癥因子分泌等[18]。本文通過RNA干擾技術對TREM-1進行沉默，發(fā)現(xiàn)TREM-1沉默可以下調(diào)DAP12表達，降低炎癥因子分泌，進一步證實TREM-1是RSV感染后炎癥失調(diào)的關鍵分子，為RSV毛細支氣管炎治療提供了新的靶點。

綜上所述，TREM-1/DAP12信號通路在RSV毛細支氣管炎患兒中高表達。RSV誘導支氣管上皮細胞高表達TREM-1，沉默TREM-1可以下調(diào)DAP12表達，降低炎癥因子分泌。