趙駿達(dá)，李曉蘭，武欣，馬俊旗*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科中心，烏魯木齊 830054；2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200082)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率較高的三大惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1-2]。盡管目前臨床上采取手術(shù)切除聯(lián)合鉑類、紫杉醇等一線化療藥物進(jìn)行綜合治療，但患者術(shù)后5年生存率并不樂(lè)觀[3-4]，而且化療藥物自身的毒副作用及腫瘤細(xì)胞化療的耐藥性都嚴(yán)重影響卵巢癌的療效[5-6]。因此，積極尋找高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑及化療增敏劑是近年來(lái)該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

雙調(diào)蛋白(amphiregulin，AREG)是上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員[7]，且作為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體之一，可通過(guò)自分泌、近端以及旁分泌多種途徑作用于EGFR，并使其產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[8]。有研究報(bào)道，AREG與EGFR相結(jié)合會(huì)顯著增加EGFR的合成，而過(guò)表達(dá)的EGFR參與細(xì)胞下游的多條信號(hào)通路的活化，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖與分化[9]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，也是EGFR信號(hào)通路的下游蛋白，它的激活可使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化并調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-ERK信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞分化、傳遞細(xì)胞外信號(hào)至細(xì)胞核，該通路的激活與細(xì)胞的增殖、分化、癌變以及惡性進(jìn)展程度密切相關(guān)[11]。經(jīng)前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，有關(guān)AREG通過(guò)EGFR-ERK信號(hào)通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞化療敏感性機(jī)制的研究尚不多見(jiàn)。因此，本研究以EGFR-ERK信號(hào)通路為切入點(diǎn)，通過(guò)抑制內(nèi)源性AREG的表達(dá)，初步探索AREG對(duì)卵巢癌細(xì)胞株COC1的增殖抑制作用、化療增敏作用及可能的作用機(jī)制，為臨床的化療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料與試劑

TRIzol試劑購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人AREG、EGFR多抗、山羊抗人ERK多抗購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruze公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)買于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；小牛血清購(gòu)買于河南華美生物工程公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)以及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Promega公司；注射用順鉑(Cisplatin，CDDP)購(gòu)買于山東齊魯制藥有限公司；BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物有限公司，紫杉醇購(gòu)于山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司。

引物通過(guò)上海生工生物工程公司合成；人卵巢癌細(xì)胞株COCl購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。Transwell小室購(gòu)于美國(guó) Corning costar公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices公司；凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)Biorad公司(型號(hào)K8500)。

二、研究方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將人卵巢癌細(xì)胞株COC1置于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，每隔1 d換一次液，每2～3 d按照1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COC1用于細(xì)胞遷移和侵襲等實(shí)驗(yàn)。

2.AREG基因的siRNA寡核苷酸序列設(shè)計(jì)與合成：利用美國(guó)Ambion公司在線設(shè)計(jì)程序，選取AREG基因cDNA序列起始點(diǎn)280個(gè)核苷酸之后的連續(xù)19 nt作為RNA干擾質(zhì)粒的特異性序列，并經(jīng)Blast同源性比較分析，設(shè)計(jì)為能表達(dá)其發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小干擾RNA(siRNA)的DNA序列，AREG-siRNA mimics質(zhì)粒(AREG-siRNA)及AREG-siRNA陰性對(duì)照(Non-siRNA)質(zhì)粒引物序列(表1)。

表1 siRNA引物序列(5’-3’)

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，按其操作說(shuō)明優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組和AREG轉(zhuǎn)染組。正常對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)；陰性轉(zhuǎn)染組(Non-siRNA)轉(zhuǎn)染由Ambion公司質(zhì)粒試劑盒所提供的非特異性質(zhì)粒；AREG轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染AREG-siRNA質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種至6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞融合度約85%左右，將質(zhì)粒與LipofectamineTM2000混合成轉(zhuǎn)染復(fù)合物(質(zhì)粒質(zhì)量∶LipofectamineTM2000=1∶1.5)，加入細(xì)胞中輕柔搖勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果表明其轉(zhuǎn)染效率為80%，繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)用于細(xì)胞遷移和侵襲等實(shí)驗(yàn)。

4.檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和對(duì)化療藥物的敏感性：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組COC1(5×103個(gè))接種于96孔板上，培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-細(xì)胞存活率)×100%。檢測(cè)COC1對(duì)化療藥物敏感性時(shí)，待細(xì)胞融合度達(dá)85%左右之后，棄去培養(yǎng)基，換用含有順鉑(CDDP，濃度為0.08 mmol/L)或紫杉醇(PTX，濃度為0.115 mmol/L)的1%小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

5.定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)AREGmRNA的表達(dá)：按照RNA分離試劑盒以及TRIzol試劑盒說(shuō)明書的操作步驟提取純化各組COC1的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增按其試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行。以各組cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系為：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl，5×Syber Green 2 μl，Primer F 1 μl，Primer R 1 μl(表2)，cDNA 2 μl，ddH2O 4 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 20 s；60℃ 30 s；75℃ 30 s，一共45個(gè)循環(huán)，采用ΔΔCT法對(duì)不同組別AREG基因差異表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2 引物序列及片段長(zhǎng)度

6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：調(diào)整COC1細(xì)胞濃度為l×106個(gè)/ml接種于6孔板，待其細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)分別以AREG-siRNA質(zhì)粒、Non-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，正常對(duì)照組不作任何處理，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次，用無(wú)菌槍頭在底板劃一直線，將刮下的細(xì)胞洗去，鏡下測(cè)量痕距。繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，鏡下分別測(cè)量痕距，計(jì)算細(xì)胞的遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率=[0 h劃痕寬度 D0-(24 h或者48 h)劃痕寬度 D1]/D0×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的上室用100 μl Matrigel膠包被，在紫外線下照射2 h。調(diào)整COC1濃度為l×106個(gè)/ml接種于6孔板，待其細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)分別以AREG-siRNA質(zhì)粒、Non-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，正常對(duì)照組不作任何處理，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后各組分別吸取200 μl細(xì)胞接種于上室，將小室置于24孔板，在下室中加入含有10%小牛血清的RPMI-1 640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。拭去上室的Matrigel膠和細(xì)胞。甲醇固定10 min后以0.1%結(jié)晶紫染液染色。在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野穿透Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8.Western blot檢測(cè)AREG、EGFR及ERK蛋白的表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期COC1，調(diào)整細(xì)胞濃度為l×106個(gè)/ml接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)85%時(shí)，分別以AREG-siRNA質(zhì)粒、Non-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，正常對(duì)照組不作任何處理，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，胰酶消化收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度。每組取50 μg的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，加入AREG、EGFR及ERK一抗(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)以及內(nèi)參蛋白β-actin一抗(稀釋倍數(shù)為1∶7 000)，4℃過(guò)夜。室溫條件下孵育二抗(稀釋倍數(shù)為1∶5 000)1 h，TBST漂洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液曝光。采用凝膠成像儀分析各目標(biāo)蛋白及內(nèi)參的灰度值，以目的條帶/內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組COC1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況

對(duì)3組卵巢癌細(xì)胞之間的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示：與AREG轉(zhuǎn)染組相比較，正常對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著降低(P<0.01)，正常對(duì)照組與陰性轉(zhuǎn)染組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，3組COC1的生長(zhǎng)抑制率均有增加，但同一組中各時(shí)間段之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

二、AREG-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)COC1中AREG mRNA表達(dá)的影響

對(duì)各組COC1中AREG基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，其結(jié)果表明：與正常對(duì)照組相比，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞AREGmRNA表達(dá)略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組相比較，AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中AREGmRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)(圖1)。

表3 各組COC1不同處理時(shí)間段的生長(zhǎng)抑制率(-±s)

注：與同時(shí)段AREG轉(zhuǎn)染組相比較，*P<0.01

與AREG轉(zhuǎn)染組比較，*P<0.01圖1 三組COC1中AREG mRNA表達(dá)水平

三、AREG-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)COC1遷移及侵襲行為的影響

各組COC1遷移及侵襲行為的統(tǒng)計(jì)分析顯示，與正常對(duì)照組相比，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移及侵襲行為被抑制，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移及侵襲行為被顯著抑制(P<0.01)；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移及侵襲行為顯著被抑制(P<0.01)；同組不同時(shí)間段的遷移率相比，48 h的遷移率顯著高于24 h(P<0.01)(表4、圖2～3)。

表4 COC1遷移率與侵襲行為比較[(-±s)，%]

注：與同時(shí)段AREG轉(zhuǎn)染組相比較，*P<0.05；與同組24 h相比較，#P<0.01；與AREG轉(zhuǎn)染組相比，ΔP<0.01

A：正常對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：AREG轉(zhuǎn)染組圖2 AREG對(duì)COC1遷移的影響(劃痕實(shí)驗(yàn))

A：正常對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：AREG轉(zhuǎn)染組圖3 AREG對(duì)COC1侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色)

四、AREG-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)COC1化療敏感性的影響

針對(duì)轉(zhuǎn)染AREG-siRNA對(duì)COC1化療敏感性的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明：對(duì)順鉑(CDDP)而言，與正常對(duì)照組相比，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的化療敏感性略有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而AREG轉(zhuǎn)染組COC1的化療敏感性顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的化療敏感性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而對(duì)于紫杉醇(PTX)而言，各組細(xì)胞的化療敏感性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表5)。

表5 三組COC1對(duì)不同藥物化療敏感性的比較(-±s)

注：同AREG轉(zhuǎn)染組相比較，*P<0.01

五、各組卵巢癌細(xì)胞COC1中AREG、EGFR及ERK蛋白的表達(dá)情況

與正常對(duì)照組相比，陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中AREG、EGFR及ERK蛋白表達(dá)水平略有下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中AREG、EGFR及ERK蛋白表達(dá)被顯著抑制(P<0.01)；與陰性轉(zhuǎn)染組相比，AREG轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中AREG、EGFR及ERK蛋白表達(dá)被顯著抑制(P<0.01)(圖4)。

A：Western Blot檢測(cè)條帶圖；B：三組COC1中AREG、EGFR 和ERK蛋白相對(duì)表達(dá)情況；與其余兩組比較，*P<0.01圖4 COC1中AREG、EGFR及ERK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平比較

討 論

卵巢癌、子宮癌以及宮頸癌并稱為女子生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤[12]。其中因卵巢位于盆腔，發(fā)病隱蔽，臨床上缺乏早期特異性的診斷方法，導(dǎo)致卵巢癌的死亡率躍居?jì)D科腫瘤之首[13]。目前順鉑作為卵巢癌臨床一線化療藥物，取得了一定的療效，但因其化療耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用，同時(shí)卵巢癌術(shù)后常發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳，患者5年的生存率低于30%，因此積極尋求高效、低度的化療增敏藥物及分子靶標(biāo)可能為卵巢癌的治療以及延緩其復(fù)發(fā)提供新的策略[14]。

有研究報(bào)道，EGFR信號(hào)失調(diào)在人類一系列上皮惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中均發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。盡管有關(guān)EGFR的表達(dá)與癌癥患者預(yù)后之間的研究報(bào)道較多，但目前就二者之間的關(guān)系尚未達(dá)成共識(shí)。Cheng等[16]研究結(jié)果顯示EGFR過(guò)表達(dá)與胰腺癌患者低生存率之間呈顯著相關(guān)性，然而也有研究報(bào)道顯示胰腺癌病人EGFR表達(dá)水平不能反映其病人的預(yù)后狀況[17]。迄今為止，有關(guān)EGFR的表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展的關(guān)聯(lián)性尚未形成理論依據(jù)。

作為EGFR配體家族的成員，雙調(diào)蛋白(AREG)通過(guò)與EGFR相結(jié)合，活化細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和遷移[18]。目前，盡管AREG在抗腫瘤免疫和耐受中的作用機(jī)制尚不清楚，但是臨床上廣泛的應(yīng)用EGFR拮抗劑治療轉(zhuǎn)移性上皮癌表明AREG可能在調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。但有關(guān)AREG-EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道較少。

ERK作為絲裂原活化蛋白激酶家族的一員，位于EGFR信號(hào)的下游，也是EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條經(jīng)典通路[20]。研究表明，ERK同時(shí)扮演著膜蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的雙重角色，在細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用[21]。而ERK的激活使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]。因此在卵巢癌微環(huán)境大量細(xì)胞因子的作用下，內(nèi)源性AREG的過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致EGFR的活化，由此觸發(fā)下游ERK通路的活化，進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲。

因此，本研究采用siRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞COC1，抑制AREGmRNA的表達(dá)，初步探索AREG調(diào)控EGFR-ERK信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療敏感性、細(xì)胞遷移及侵襲行為的影響。由研究結(jié)果可知：通過(guò)AREG-siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)內(nèi)源性AREG表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞COC1的生長(zhǎng)抑制率顯著高于正常對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組；且經(jīng)AREG-siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)后，卵巢癌細(xì)胞COC1的遷移及侵襲性被顯著抑制，且對(duì)順鉑化療藥物的敏感性顯著提高，大約是正常癌細(xì)胞的3倍，對(duì)紫杉醇藥物的敏感性也有所增加，但與其他組相比，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)AREG-siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)后，卵巢癌細(xì)胞中AREGmRNA水平及蛋白水平較其他兩組均降低，且EGFR、ERK的蛋白表達(dá)水平與其他兩組相比，也降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，本研究通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，干擾內(nèi)源性AREG的表達(dá)，抑制了COC1的增殖、遷移和侵襲，增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞COC1對(duì)順鉑化療的敏感性，其可能作用機(jī)制與AREG調(diào)控EGFR-ERK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，為逆轉(zhuǎn)化療耐藥性及卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但有關(guān)AREG調(diào)控EGFR-ERK信號(hào)通路具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步探討。