劉琳，王靜怡，王欣，王麗萍，張曉梅，呂芳*

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001；2.江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，揚(yáng)州 225001；3.大連醫(yī)科大學(xué)，大連 116044)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的生殖內(nèi)分泌疾病，影響5%～10%的育齡期婦女[1]。PCOS有遺傳傾向性，但發(fā)病機(jī)制仍不清楚。卵泡發(fā)育異常被認(rèn)為是PCOS的共同特征，約占無排卵性不孕的75%[2]。雌性卵母細(xì)胞早在胚胎期就已形成[3-4]，而卵泡液是卵母細(xì)胞生長過程中直接接觸的內(nèi)部環(huán)境。PCOS患者卵泡液中的糖蛋白、乙酸鹽、谷氨酰胺和丙氨酸表達(dá)異常，會影響卵母細(xì)胞的發(fā)育[5]。

外泌體是直徑為30～100 nm的納米級脂質(zhì)包涵體結(jié)構(gòu)，包裹轉(zhuǎn)運(yùn)多種物質(zhì)如miRNA和lncRNA(long non-coding RNA)等[6]，主要通過細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用[7]。體內(nèi)幾乎每種細(xì)胞都可以分泌外泌體，這些外泌體會在血液[8]、唾液[9]、卵泡液[10]和人乳[11]等體液中釋放，并最終被吞噬。外泌體是細(xì)胞間通訊的重要媒介[12-13]，可保護(hù)信號不被降解[14]，并且其所攜帶的蛋白質(zhì)和RNA含量可反映原細(xì)胞的狀態(tài)[15]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，不編碼蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞分化、發(fā)育和遺傳調(diào)控，包括表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在新陳代謝中起著重要作用[16-17]。目前l(fā)ncRNA在PCOS發(fā)病機(jī)理中的作用仍知之甚少，本研究通過分離純化卵泡液外泌體，提取外泌體中RNA進(jìn)行l(wèi)ncRNAs測序，確定PCOS患者卵泡液外泌體的全基因組lncRNA表達(dá)譜，為lncRNA用作生物標(biāo)志物或潛在的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年1～12月于蘇北人民醫(yī)院生殖中心就診的不孕患者卵泡液，患者年齡≤35歲。根據(jù)患者不孕原因分為PCOS組和對照組。PCOS組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷；(2)稀發(fā)排卵或無排卵；(3)B超顯示卵巢多囊樣改變。對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢陰道超聲檢查正常；(2)性激素水平正常；(3)雙側(cè)竇卵泡計數(shù)6～10個；(4)月經(jīng)周期正常(26～32 d)；(5)不孕僅由輸卵管因素引起。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)由其他疾病引起的不孕癥如原發(fā)性下丘腦閉經(jīng)、原發(fā)性卵巢功能衰竭、催乳素紊亂和其他下丘腦垂體卵巢軸器官的器質(zhì)性和功能性疾病；(2)內(nèi)分泌疾病如庫欣綜合征、高泌乳素血癥、肢端肥大癥、先天性腎上腺增生、甲狀腺疾病和雄激素分泌性腫瘤；(3)生殖系統(tǒng)疾病如子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢手術(shù)或放療和化療史；(4)以及其他遺傳性疾病如特發(fā)性毛發(fā)和藥物引起的雄激素過多癥等。

本研究共收集56例患者卵泡液。其中PCOS組28例；對照組28例。比較兩組患者的臨床資料，并且每組隨機(jī)挑選3例患者的卵泡液外泌體送至和元公司進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序分析。

二、試劑和儀器

TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(RR820A，TAKARA，日本)；PrimeScriptRT試劑盒(RR037A，TAKARA，日本)；Amicon Ultra-15離心過濾器(30 kDa，UFC903096，Millipore，德國)；NanoSight分析系統(tǒng)(Particle Metrix，德國)；MiRNeasy Mini Kit(Cat.217004，QIAGEN，德國)；NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific，美國)；熒光定量PCR儀(7900HT，ABIPRISM，美國)。

三、實驗方法

兩組患者均采用GnRH激動劑長方案進(jìn)行促排卵并收集卵泡液。隨機(jī)從PCOS組和對照組各取3例患者的卵泡液(分別命名為PCOS組1～3號和對照組1～3號)進(jìn)行如下研究。

1.促排卵和卵泡液外泌體的分離與鑒定：收集的卵泡液在4℃按500g5 min、3 000g25 min、10 000 g 60 min順序離心，收集上清液并在超高速離心機(jī)中于4℃以110 000g離心2次，每次70 min。為了鑒定分離的外泌體，透射電子顯微鏡(TEM)觀察外泌體形態(tài)，Western Blot檢測外泌體標(biāo)記分子CD9的表達(dá)以及NanoSight分析(NTA)測量外泌體濃度粒徑。

2.外泌體RNA提取、分離和測序：使用QIAGEN miRNeasy Mini Kit試劑盒從外泌體中提取總RNA，并測試其完整性，檢測其濃度，送至和元生物技術(shù)有限責(zé)任公司并進(jìn)行高通量測序分析。

3.卵泡液外泌體RNA生物信息學(xué)分析：Cluster軟件將相似表達(dá)的基因聚集在一起，形成熱圖，利用Top Go軟件提供GO富集分析，分析靶基因的細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)過程。同時，利用KOBAS(http：∥kobas.cbi.pku.edu.cn)軟件對差異基因顯著富集的信號通路進(jìn)行功能注釋，了解與差異表達(dá)基因相關(guān)的信號通路。

4.RT-qPCR驗證：選取差異表達(dá)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNMT2，也稱為tRNA天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1，TRDMT1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)、H19以及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的激酶1(SGK1)，從PrimerBank(https：∥pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)搜索要檢測基因的引物序列，各基因引物序列見表1，實時定量PCR(RT-qPCR)進(jìn)行驗證。RT-qPCR實時定量PCR反應(yīng)體系(20 μl)：10 μl TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.4 μl 上游引物(10 μmol/L)，0.4 μl 下游引物(10 μmol/L)，1.0 μl cDNA模板和ddH2O，每組重復(fù)3次。

表1 引物序列

四、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、兩組患者的基本臨床資料

兩組患者間年齡、總孕酮、雌激素(E2)、FSH、獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)、空腹血糖和催乳素(PRL)均無顯著差異(P>0.05)。體重指數(shù)(BMI)、LH和竇卵泡數(shù)均存在顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者的基本臨床資料比較[(-±s)，%]

注：與對照組比較，*P<0.05

二、卵泡液中分離的外泌體

TEM結(jié)果顯示外泌體是具有典型的雙層膜結(jié)構(gòu)的圓形囊泡(圖1A)。NTA結(jié)果顯示所獲外泌體顆粒的濃度為4.9×106個/ml，外泌體峰直徑為127 nm(圖1B)。同時Western Blot結(jié)果顯示，所獲得的卵泡液外泌體中檢測到外泌體標(biāo)記分子CD9蛋白條帶(圖1C)。以上結(jié)果證實卵泡液外泌體提取成功。

A：電鏡圖(箭頭所指為外泌體)；B：外泌體粒徑圖；C：Western Blot檢測圖1 外泌體的分離和鑒定結(jié)果

三、卵泡液中外泌體RNA定量及完整性

利用NanoDrop ND-2000進(jìn)行RNA定量，外泌體RNA的A260/280比值在1.1～1.6之間(表3)。進(jìn)一步經(jīng)過Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)檢測RNA完整性，RNA質(zhì)檢毛細(xì)管電泳圖可見明顯的RNA峰圖(圖2)，表明RNA完整性合格。RNA完整值(RNA integrity number，RIN)作為檢測RNA完整性的一個指標(biāo)，表明本項研究外泌體RNA質(zhì)檢合格，符合進(jìn)一步建庫測序的要求。

表3 外泌體RNA定量結(jié)果

A1～A3：為對照組1～3號；B1～B3：為PCOS組1～3號圖2 外泌體RNA完整性質(zhì)檢結(jié)果

四、差異lncRNA火山圖結(jié)果

兩組中差異表達(dá)lncRNA的火山圖，篩查閾值默認(rèn)設(shè)置為P≤0.05。差異表達(dá)的lncRNA用紅點(表達(dá)上調(diào))，藍(lán)點(表達(dá)下調(diào))和灰點(無顯著性差異)標(biāo)記，PCOS患者卵泡液外泌體中l(wèi)ncRNA的共有1 866個基因差異表達(dá)，其中1 253個基因上調(diào)，613個基因下調(diào)(圖3)。

圖3 差異表達(dá)的lncRNA火山圖

五、lncRNA的聚類分析

使用Cuffdiff軟件計算lncRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的FPKM(每百萬片段外顯子每千堿基的片段數(shù))，同一生物學(xué)過程中，PCOS患者卵泡液的外泌體中差異表達(dá)了3 204個lncRNA轉(zhuǎn)錄本(圖4)。

A1～A3：為對照組1～3號；B1～B3：為PCOS組1～3號。 橙色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)圖4 lncRNA差異聚類分析

六、GO和KEGG信號通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示，差異lncRNA在生物學(xué)過程方面主要富集于組織細(xì)胞成分或生物發(fā)生、組織細(xì)胞成分；細(xì)胞組分方面主要富集于細(xì)胞內(nèi)；分子功能方面主要富集于如黏附、蛋白質(zhì)結(jié)合等(圖5)。KEGG通路結(jié)果顯示，差異lncRNA在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、胰島素信號通路、胰島素抵抗、胰島素分泌、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、雌激素信號等通路富集(圖6)。

七、RT-qPCR驗證差異基因的表達(dá)水平

差異表達(dá)的DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、H19和SGK1 RT-qPCR驗證結(jié)果顯示，在PCOS患者卵泡液外泌體中DNMT1、DNMT2、DNMT3A和H19的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，而SGK1表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖7)。RT-qPCR驗證結(jié)果與測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

圖5 GO富集圖

圖6 KEGG信號通路

注：與對照組比較，*P<0.05圖7 差異基因的RT-qPCR驗證結(jié)果

討 論

PCOS常表現(xiàn)為家族遺傳性終身性疾病，與月經(jīng)失調(diào)、無排卵性不育[18]、高雄激素血癥[19]、血脂異常[20]和胰島素抵抗[21]有關(guān)。在本研究中，我們挑選PCOS患者卵泡液外泌體中，差異表達(dá)的6個lncRNA(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、H19和SGK1)，并通過RT-qPCR驗證與測序結(jié)果一致。差異表達(dá)lncRNA的GO和KEGG信號通路分析表明，它們在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂以及胰島素信號通路、胰島素抵抗中起著重要作用。這些潛在的功能和途徑可能與PCOS的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。外泌體可通過體液到達(dá)遠(yuǎn)端的器官，然后通過釋放攜帶的因子影響器官的新陳代謝[22]。外泌體內(nèi)的RNA可以在細(xì)胞之間穿梭，并通過細(xì)胞間通訊影響受體細(xì)胞[23]。研究表明，特定的lncRNA參與了各種疾病的發(fā)展，如糖尿病[24]、生殖系統(tǒng)腫瘤[25]和克氏綜合征[26]。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)lncRNA CD36-005與PCOS的發(fā)病有關(guān)。Liu等[28]發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)的失調(diào)可能在顆粒細(xì)胞增殖和類固醇生成中起重要作用，并證明了lncRNA HCG26在PCOS患者中表達(dá)上調(diào)，并且與竇卵泡的數(shù)量有關(guān)。

DNA甲基化是關(guān)閉某些基因活性的表觀遺傳機(jī)制之一，導(dǎo)致基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性發(fā)生變化。Jia等[29]發(fā)現(xiàn)卵泡液中同型半胱氨酸水平Hcy的增加與DNMT1表達(dá)的上調(diào)和mtDNA的高甲基化有關(guān)。這些代謝和表觀遺傳變化可能導(dǎo)致線粒體功能受損，最終導(dǎo)致來自PCOS母羊的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。盡管我們的研究結(jié)果與之相反，這也許是由于物種不同，但這些研究都表明DNMT1在PCOS中起調(diào)節(jié)作用。另外，有研究證明DNMT1在卵母細(xì)胞的產(chǎn)生和胚胎的存活中起著重要的作用[30]?；加蠵COS的女性卵泡中的雄激素過多會降低DNMT并改變表觀遺傳表達(dá)，PCOS患者顆粒細(xì)胞中DNMT1和DNMT3A的表達(dá)低于正常組[31]，我們的研究結(jié)果與之一致。

DNMT2被認(rèn)為與許多過程的調(diào)控有關(guān)，但其生物學(xué)效應(yīng)和潛在的分子機(jī)制仍不清楚。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)，精子中非編碼小RNA介導(dǎo)的DNMT2的敲除可以中斷父方代謝疾病向后代的傳播。哺乳動物DNA甲基化的建立和維持取決于DNMT3A和DNMT3B，它們負(fù)責(zé)在配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)生過程中修飾DNA甲基化[33-34]。盡管甲基化模式隨發(fā)育階段和細(xì)胞類型而異，但DNMT3B對于在胚胎發(fā)生過程中介導(dǎo)從頭甲基化是必需的。

本研究結(jié)果表明PCOS患者的卵泡液外泌體中確實存在差異表達(dá)的lncRNA，但是關(guān)于lncRNA在卵泡液外泌體中的表達(dá)及其作用途徑的研究仍然很有限。鑒于本研究的樣本量較少的局限性，今后有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究，以闡明這些差異表達(dá)lncRNA的分子機(jī)制。