劉科鵬，李麗斐，成慧，劉媛，張學(xué)紅*

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖?？漆t(yī)院，蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，蘭州 730000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功的關(guān)鍵是優(yōu)質(zhì)的胚胎和子宮內(nèi)膜同步化發(fā)育以及兩者之間的協(xié)調(diào)配合。盡管近年來輔助生殖技術(shù)有了很大發(fā)展，但反復(fù)種植失敗(RIF)仍然是患者和臨床醫(yī)生共同面臨的難題。很多患者經(jīng)歷多次助孕失敗，導(dǎo)致很大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Thornhill等[1]將RIF定義為至少連續(xù)3次IVF周期植入失敗，其中每個周期移植1～2枚高質(zhì)量的胚胎或多次移植胚胎數(shù)量共計≥10枚仍未獲得臨床妊娠。IVF-ET過程中，反復(fù)種植失敗的發(fā)生率為7.7%～11.1%，植入失敗與母親因素及胚胎因素有關(guān)，母親因素包括子宮解剖異常、血栓形成、降低的子宮內(nèi)膜容受性和免疫因素；胚胎因素與遺傳異?；蚺咛ス逃械钠渌蛩赜嘘P(guān)[2]。其中由于子宮內(nèi)膜容受性下降導(dǎo)致的植入失敗占到總數(shù)的2/3[3]。因此，采取有效措施改善子宮內(nèi)膜容受性成為RIF研究的熱點(diǎn)。通過患者全血離心獲得的血漿血小板濃縮物稱為富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)，2015年，Chang等[4]首先描述了子宮腔內(nèi)灌注PRP可以治療薄型子宮內(nèi)膜。Zadehmodarres等[5]也描述了PRP促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育的有效性。本研究通過回顧性分析，探討使用宮腔內(nèi)灌注PRP能否提高反復(fù)種植失敗婦女子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)而提高再次IVF-ET后的臨床妊娠率。

一、資料與方法

1.研究對象：選擇2018年2月至2019年1月于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖?？漆t(yī)院就診的RIF婦女，再次IVF-ET治療前接受過PRP灌注的患者；另取同期未經(jīng)PRP灌注的匹配RIF患者為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≤40歲；(2)有連續(xù)3次及以上胚胎種植失敗史；(3)不孕因素主要包括盆腔輸卵管因素、排卵障礙、男方因素；(4)宮腔鏡檢查，子宮形態(tài)正常；(5)卵巢功能正常[血清FSH、LH、抗苗勒氏管激素(AMH)水平均處于正常范圍]，自然排卵周期或使用促性腺激素刺激卵泡發(fā)育周期中，至少有1個卵泡發(fā)育至直徑≥18 mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有雌激素相關(guān)性腫瘤病史；(2)宮腔鏡檢查顯示宮腔形態(tài)異常、宮腔粘連、內(nèi)膜息肉、黏膜下子宮肌瘤等；(3)內(nèi)膜異常增生、內(nèi)膜結(jié)核及內(nèi)膜炎等內(nèi)膜病變；(4)子宮腺肌癥；(5)雙側(cè)輸卵管積水；(6)甲狀腺功能異常、血液病等全身性疾病。本研究共納入127例患者。觀察組63例患者于再次行IVF-ET術(shù)前行PRP宮腔灌注，對照組64例患者IVF-ET術(shù)前未行PRP宮腔灌注。

2.控制性超促排卵方案：月經(jīng)前黃體中期使用長效促性腺激素釋放激動劑(GnRH-a)(曲普瑞林，輝凌，德國)1.4 mg 肌肉注射，14 d后進(jìn)行B超和血清E2水平檢查，如達(dá)到垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)，開始注射重組人FSH(果納芬，默克雪蘭諾，意大利)75～150 U/d，通過B超和激素水平(血清FSH、LH、E2、孕酮)監(jiān)測卵泡發(fā)育，主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm時，肌肉注射重組人HCG(艾澤，輝凌，德國)250 μg，36 h后取卵。取卵后即開始肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d進(jìn)行黃體支持，取卵3 d后進(jìn)行胚胎移植。根據(jù)胚胎數(shù)目和形態(tài)進(jìn)行評分，選擇評分最高的2～3枚胚胎進(jìn)行移植。

3.PRP的制備及應(yīng)用：如先前報道，PRP由自體血液采用兩次離心法制備[6]。月經(jīng)結(jié)束后第3天使用預(yù)先裝有5 ml 3.2%檸檬酸鈉抗凝溶液的注射器抽取15 ml患者自身靜脈血，立即于18℃下以相對離心力300g離心 10 min。離心后形成三層，底部為紅細(xì)胞層，上清液為血漿層，中間為血沉棕黃層。將上面的2層轉(zhuǎn)移到新的無菌離心管中，然后在18℃下以700g再次離心15 min。丟棄約四分之三的上清液后，從離心管底部吸取1 ml PRP，添加凝血酶粉末(25 U/ml，Sigma-Aldrich，美國)和氯化鈣(20 mmol/ml，Kalmia，美國)以激活PRP。PRP激活后立即進(jìn)行宮腔灌注，患者于檢查床上取膀胱截石位，用窺陰器暴露宮頸，消毒外陰及陰道。使用注射器吸取1 ml PRP后連接移植管。移植管穿過宮頸口，將PRP緩慢推入宮腔內(nèi)，灌注后患者靜臥30 min。

4.妊娠判斷：胚胎移植后14 d查血β-HCG水平，血β-HCG≥50 IU/L定義為HCG陽性。30 d后行B超檢查宮腔，了解有無胚囊及其數(shù)目，B超檢查探及宮內(nèi)孕囊中有胚芽及心管搏動即為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)及計算：子宮動脈搏動指數(shù)(PI)、子宮動脈阻力指數(shù)(RI)；胚胎種植率=B超檢查發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%。臨床妊娠率=獲得臨床妊娠的患者數(shù)/總患者數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1.兩組患者的一般資料及促排卵情況：兩組患者的年齡、不孕年限、不孕原因等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者血清基礎(chǔ) FSH 值、Gn 使用天數(shù)及總量和獲卵數(shù)等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表 1)。

2.治療后兩組間子宮內(nèi)膜厚度、子宮動脈血流參數(shù)比較：HCG注射日和胚胎移植日觀察組子宮內(nèi)膜厚度均顯著大于對照組(P<0.05)，子宮動脈搏動指數(shù)(PI)、子宮動脈阻力指數(shù)(RI)均顯著小于對照組(P<0.05)(表 2)。

3.兩組患者的胚胎移植情況及妊娠結(jié)局：統(tǒng)計結(jié)果顯示，兩組患者移植胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，觀察組的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于對照組(P<0.01)(表 3)。

表1 兩組患者一般資料及促排卵情況比較[(-±s)，n(%)]

表2 兩組間HCG注射日和胚胎移植日內(nèi)膜厚度、子宮動脈血流參數(shù)比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 兩組患者胚胎移植及妊娠結(jié)局比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.01

三、討論

在自然月經(jīng)周期中，當(dāng)胚胎發(fā)育到胚泡期時，人的子宮內(nèi)膜會在排卵后約6 d接受植入。胚泡與子宮內(nèi)膜間發(fā)生一系列復(fù)雜的相互作用，導(dǎo)致胚胎附著在宮腔上皮上，隨后侵入基質(zhì)，從而與母體脈管系統(tǒng)建立聯(lián)系，良好的子宮內(nèi)膜容受性是胚胎能夠順利植入的前提[7]。B超下子宮內(nèi)膜的性狀如厚度、形態(tài)、血流等可以直觀地反映子宮內(nèi)膜狀況，也是評估子宮內(nèi)膜容受性最重要的指標(biāo)。子宮內(nèi)膜血流、厚度、類型在月經(jīng)周期中表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。圍排卵期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞迅速增生，表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體增生，螺旋動脈血流灌注更加豐富，RI、PI、臍動脈舒張壓血流速度高低比值(S/D值)降低，血流呈低阻力，子宮內(nèi)膜血流灌注情況可以直接反映胚胎著床部位的微環(huán)境，對于受精卵成功著床非常重要，形態(tài)上則出現(xiàn)“三線征”。三線征同樣提示了良好的子宮內(nèi)膜血流灌注，胚胎種植前子宮內(nèi)膜主要表現(xiàn)為細(xì)胞的增生、分化和血液供應(yīng)的增加，且腺體與間質(zhì)發(fā)育同步。另一個子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學(xué)指標(biāo)為胞飲突，其作用可能為使宮腔上皮可以更好地吸附胚泡。因此，胚泡著床能力與胞飲突的數(shù)量存在正相關(guān)關(guān)系。胞飲突的數(shù)量可以作為子宮內(nèi)膜容受性和植入窗打開的微觀形態(tài)學(xué)指標(biāo)，分泌期胞飲突的增多意味著子宮內(nèi)膜處于最佳狀態(tài)。

PRP是自體血液的一部分，是通過患者全血離心后獲得的血小板濃縮物。血小板在其細(xì)胞質(zhì)顆粒中儲存了各種生長因子和細(xì)胞因子，這些顆粒在激活因子(例如細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白)存在下會發(fā)生胞吐作用從血小板中釋放出來[8]。PRP中發(fā)現(xiàn)的多種細(xì)胞因子和生長因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和白細(xì)胞介素8(IL-8)[9]，因此，向患者給予PRP宮腔灌注也代表了大量細(xì)胞因子和趨化因子的輸注。細(xì)胞因子和生長因子在胚胎植入過程中發(fā)揮的重要作用是眾所周知的，由血細(xì)胞儲存和釋放的這些信號分子可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移，增殖和分化[10]，進(jìn)而促進(jìn)正常生理?xiàng)l件下的子宮內(nèi)膜生長和胚胎植入過程。本研究結(jié)果顯示，HCG注射日和胚胎移植日觀察組子宮內(nèi)膜厚度均顯著大于對照組(P<0.05)，子宮動脈搏動指數(shù)(PI)、子宮動脈阻力指數(shù)(RI)均顯著小于對照組(P<0.05)，這意味著PRP宮腔灌注可以增加子宮內(nèi)膜厚度，改善子宮內(nèi)膜血流，繼而改善了子宮內(nèi)膜容受性。

使用自體PRP進(jìn)行生育治療的第1份報告來自于不孕的母馬，結(jié)果表明交配前接受PRP宮腔灌注的母馬其妊娠率顯著增加[11]。另一項(xiàng)使用體外牛子宮內(nèi)膜炎癥模型的研究表明，經(jīng)PRP處理的細(xì)胞具有更高的增殖速率，并且參與植入的若干基因表達(dá)更高[12]。Chang等[4]報道了薄型子宮內(nèi)膜(<7 mm)患者輸注PRP后子宮內(nèi)膜生長和妊娠結(jié)局更好。之后另外幾項(xiàng)研究分別報道了 PRP 宮腔灌注可以改善薄型子宮內(nèi)膜生長和妊娠結(jié)局[13-14]。本研究回顧性分析發(fā)現(xiàn)將PRP應(yīng)用于反復(fù)種植失敗婦女再次IVF-ET過程中行PRP宮腔灌注能改善臨床妊娠結(jié)局，觀察組與對照組相比較，胚胎種植率(20.69% vs 9.09%)、臨床妊娠率(42.85% vs 18.75%)均顯著提高(P<0.01)，與以往研究結(jié)果一致。由于對PRP宮腔灌注的研究時間并不長，我們對其機(jī)制和原理知之甚少。一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)表明，活化的PRP可以促進(jìn)人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、骨髓源性MSC和子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的遷移、增殖和分化[15]。這些數(shù)據(jù)為使用自體PRP增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性提供了機(jī)制原理的初步證據(jù)，最新的研究報告顯示PRP宮腔灌注可以促進(jìn)新血管生成，該研究表明，不孕婦女在凍融胚胎移植周期中子宮內(nèi)膜欠佳時進(jìn)行PRP灌注，通過多普勒超聲觀察到的血管信號數(shù)量顯著增加，到達(dá)子宮內(nèi)膜3區(qū)和4區(qū)的血管數(shù)量增加[16]。因此我們推測PRP宮腔灌注可以加速內(nèi)膜的生長和與胚胎發(fā)育的同步化，促進(jìn)子宮內(nèi)膜螺旋動脈的生成，增加內(nèi)膜血流，增加胚胎種植的營養(yǎng)供給，改善子宮內(nèi)膜容受性。

綜上所述，PRP宮腔灌注能提高反復(fù)種植失敗婦女再次IVF-ET術(shù)后的胚胎種植率和臨床妊娠率，改善妊娠結(jié)局。