姚艷玲，張靜，李林林，黃小溪，買提娜什·那吾塔依，黃云飛，張晨*

(1.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，烏魯木齊 830001)

香煙燃燒后，其煙霧中含有尼古丁、苯并 A-芘、可尼丁、鎘、一氧化碳等大量有害物質(zhì)，這些有害物質(zhì)嚴重損傷男性生殖功能，甚至損傷睪丸組織結(jié)構(gòu)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，吸煙引起的雄性大鼠生殖系統(tǒng)功能與結(jié)構(gòu)的損傷，與睪丸組織中細胞凋亡及組蛋白乙?；揎椨嘘P[2]。多項研究表明，尼古丁可以調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞[3]、人肺泡間質(zhì)成纖維細胞[4]、舌鱗狀細胞[5]、人氣道上皮細胞[6]等多種細胞中wnt/β-catenin信號通路。Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，wnt家族是由19個富含半胱氨酸的糖蛋白組成的蛋白家族，它們不僅在胚胎發(fā)育和維持機體的自穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用，而且在細胞的增殖、分化、運動以及抗凋亡過程中也起著重要作用[7]。以往研究發(fā)現(xiàn)，激活wnt/β-catenin信號通路可促進成人睪丸支持細胞的增殖，去睪丸骨質(zhì)疏松小鼠wnt/β-catenin信號通路受到抑制，提示睪丸組織生長發(fā)育過程與wnt/β-catenin信號通路息息相關[8]。本文利用不同劑量的香煙煙霧暴露不同時間損傷的大鼠模型，觀察香煙煙霧對睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷及其對wnt/β-catenin信號通路分子表達的影響，以期進一步解釋香煙煙霧對睪丸組織損傷的分子機制。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

1.實驗動物：由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供清潔級8周齡雄性SD大鼠200只，體重為180～220 g，實驗動物許可證：SYXK(新)2017-0001。動物實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批準號：IACUC-20170706-05)。

2.主要試劑：某品牌的過濾嘴香煙(煙氣煙堿量1.2 mg，焦油量10 mg，新疆卷煙廠)。大鼠來源的Wnt-2b、β-catenin、GSK-3β及GAPDH引物序列見表1。兔抗大鼠多克隆一抗：wnt-2b抗體(ab178418)購自英國Abcam公司；β-catenin抗體(AF6266209794)、磷酸化-β-catenin抗體(Ser33/37/Thr41，DF2989209794)及GSK-3β抗體(AF501628373)均購自美國Affnity公司；GAPDH抗體(10494-1-AP)購自美國Proteintech公司。HRP標記的二抗購自北京中杉金橋試劑公司。

表1 RT-PCR睪丸組織中相關基因引物序列表

二、研究方法

1.實驗動物分組：適應性喂養(yǎng)一周后，按照香煙暴露劑量分為4大組：正常對照組(0根香煙/d，即新鮮空氣)，低劑量組(10根香煙/d)，中劑量組(20根香煙/d)和高劑量組(30根香煙/d)。每組按照香煙暴露時間又分為2周、4周、6周、8周和12周共5個亞組。每個亞組10只動物。給予普通飼料，自由進食，飼養(yǎng)室溫度控制在(24±2)℃，濕度控制在40%～60%。

2.動物模型建立：參照課題組之前的造模方法[10]，采用呼吸道靜式染毒法。染毒組大鼠置于自制染毒箱內(nèi)(80 cm×60 cm×80 cm)，每個染毒箱中每次放置2～3籠大鼠(共計10～15只)。低劑量組一次性點燃10支香煙，煙霧進入染毒箱內(nèi)，10 min左右香煙燃盡后，大鼠暴露于香煙煙霧中0.5 h，打開染毒箱通風30 min，拿出染毒組大鼠。同樣的方法每次點燃20支香煙和30支香煙進行中、高劑量組大鼠的染毒。每日一次，每次0.5 h。相應暴露時間結(jié)束后立即處死大鼠。對照組大鼠每日被放置于與染毒組染毒箱完全相同的裝置內(nèi)，但未進行被動吸煙的操作。

3.標本采集：相應染毒時間結(jié)束，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉，分離雙側(cè)睪丸組織，以 4℃生理鹽水漂洗，用濾紙吸干水分，一側(cè)睪丸組織固定于4%的多聚甲醛中，進行HE染色，觀察睪丸組織的病理改變。另一側(cè)睪丸組織液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

4.分子檢測：采用RT-PCR及Western blot方法測定睪丸組織中wnt-2b、catenin及GSK-3β基因在mRNA及蛋白水平上的表達。

5.基因和蛋白定量計算：選取大鼠睪丸組織中GAPDH為內(nèi)參基因，mRNA表達水平計算方法主要采用相對表達量=2-ΔΔCt法，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt暴露組-ΔCt對照組。蛋白相對量的表達利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行條帶灰度值分析，檢測目標蛋白與GAPDH的灰度比值。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、香煙煙霧對大鼠一般情況的影響

隨著暴露時間和暴露劑量的增加，和正常對照組相比，低劑量暴露組的體重增長沒有受到明顯的抑制，吸煙6周后出現(xiàn)皮毛發(fā)黃，12周后出現(xiàn)自主活動減少；中劑量暴露組的體重增長在吸煙4周后出現(xiàn)明顯抑制，吸煙8周后出現(xiàn)相互撕咬等煩躁的情況；高劑量暴露組的體重增長全程均受到明顯抑制，并在吸煙6周后出現(xiàn)精神欠佳、自主活動減少，8周后出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)現(xiàn)象。

二、香煙煙霧對雄性大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組的睪丸組織中曲細精管基膜完整，曲細精管中各級精母細胞發(fā)育正常、排列整齊、層次清楚，管腔中央可見大量成熟精子，且支持細胞及間質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)正常(圖1A、E、I、M、Q)。

圖1 各組大鼠睪丸組織HE染色(×100)；標尺=100 μm

低劑量暴露組從第4周開始(圖1F)曲細精管間隙增寬，第6周(圖1J)曲細精管基底膜發(fā)生破裂，第8周(圖1N)出現(xiàn)缺乏各級精母細胞的空曲細精管，間質(zhì)中血管出現(xiàn)充血、水腫，第12周(圖1R)空曲細精管間隙增寬更加明顯，間質(zhì)中血管出現(xiàn)充血、水腫。中劑量暴露組從第4周(圖1G)開始曲細精管基底膜發(fā)生破裂，各級生精細胞排列紊亂，第6周(圖1K)出現(xiàn)缺乏各級精母細胞的曲細精管，官腔中央成熟精子數(shù)目減少或未見成熟精子，第8周(圖1O)出現(xiàn)大范圍空管樣曲細精管，第12周(圖1S)出現(xiàn)更大范圍空管樣曲細精管。高劑量暴露組從第2周(圖1D)開始曲細精管間隙變寬，第4周(圖1H)曲細精管間隙變得更寬，各級生精細胞排列紊亂，第6周(圖1L)出現(xiàn)大面積的無各級精母細胞的曲細精管，間質(zhì)血管周圍出現(xiàn)中性粒細胞浸潤，第8周(圖1P)出現(xiàn)更大面積的無各級精母細胞的空曲細精管，間質(zhì)血管周圍出現(xiàn)中性粒細胞浸潤，第12周(圖1T)曲細精管萎縮明顯，官腔中央未見成熟精子，間質(zhì)增寬異常明顯，間質(zhì)血管周圍出現(xiàn)中性粒細胞浸潤。

三、香煙煙霧對雄性大鼠睪丸組織中 wnt-2b、β-catenin及GSK-3β基因mRNA表達水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，隨著暴露時間的延長和暴露劑量的增加，wnt-2b mRNA表達水平在8周中劑量暴露組及12周中、高劑量暴露組均出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)(圖2A)；β-catenin mRNA表達水平在各劑量暴露組均出現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.01)(圖2B)；GSK-3β mRNA表達水平在8周及12周中、高劑量暴露組中均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2C)。

A：wnt-2b；B：β-catenin；C：GSK-3β；與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01圖2 不同時間和劑量的煙霧暴露對大鼠睪丸組織中wnt-2b、β-catenin及GSK-3β基因mRNA表達水平的影響

四、香煙煙霧對雄性大鼠睪丸組織中wnt-2b、β-catenin、P-β-catenin以及GSK-3β蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，和正常對照組相比，香煙暴露組大鼠睪丸組織中wnt-2b、β-catenin蛋白表達水平隨著暴露時間和暴露劑量的增加而減少，以8周和12周暴露組減少最為顯著(P<0.05)，P-β-catenin和GSK-3β蛋白表達水平隨著暴露時間和暴露劑量的增加而升高(P<0.05)(圖3)。

A：wnt-2b；B：β-catenin；C：P-β-catenin；D：GSK-3β；與正常對照組比較，*P<0.05，#P<0.01圖3 不同時間和劑量的煙霧暴露對大鼠睪丸組織中蛋白表達水平的影響

討 論

wnt通路有三條：經(jīng)典的wnt途徑、wnt/PCP(planner cell polarity pathway)通路和非經(jīng)典的wnt/Ca2+途徑[11]。經(jīng)典和非經(jīng)典途徑之間的區(qū)別就是是否依賴于β-catenin蛋白，經(jīng)典途徑依靠其發(fā)揮作用，而非經(jīng)典途徑不依賴于β-catenin，通過釋放胞內(nèi)Ca2+來影響細胞粘連和相關基因表達。一般提到wnt信號通路主要指的是由β-catenin介導的經(jīng)典wnt信號通路。wnt信號通路的激活需要其與細胞表面的配體Frizzled(Fz)家族受體結(jié)合，磷酸化細胞內(nèi)Dishevelled(Dsh)蛋白。Dsh是wnt信號通路三條途徑中共同的調(diào)節(jié)蛋白。通常，在沒有wnt蛋白的情況下，β-catenin不能在細胞質(zhì)中積累，因為它會被降解復合物(APC，Axin和GSK3)降解，隨后將通過蛋白酶體消化。在經(jīng)典wnt途徑中，降解復合物(APC，Axin和GSK3)會受到破壞，wnt蛋白與細胞膜表面的受體Frizzled(Fz)相結(jié)合，引起β-catenin蛋白在胞漿中聚集，隨后，β-catenin移位至細胞核[12]。在細胞核中，β-catenin蛋白結(jié)合TCF/LEF啟動子，進一步調(diào)控靶基因的表達，包括AXIN2和C-myc等。因此，Wnt信號的激活就是指分泌型的配體蛋白Wnt與膜表面受體蛋白FZD結(jié)合后，激活胞內(nèi)蛋白DVL。DVL通過抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解復合物的降解活性，穩(wěn)定細胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin蛋白。胞漿中穩(wěn)定積累的β-catenin進入細胞核后結(jié)合LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子家族，啟動下游靶基因(如c-myc、Cyclin D1等)的轉(zhuǎn)錄。Wnt信號通路在機體增殖、分化、炎癥和凋亡等多個生物學過程中都起重要作用[13-14]。研究表明，人或小鼠的肺腫瘤組織均有非磷酸化β-catenin表達，特別是經(jīng)過香煙煙霧的刺激后，無磷酸化β-catenin的表達顯著增加。另外，已經(jīng)證實，尼古丁可以調(diào)節(jié)多種細胞中的wnt/β-catenin途徑[3-5，8]。

雄性哺乳動物從青春期到死亡，生精細胞歷經(jīng)發(fā)生、增殖與成熟最終形成精子，這其中非常重要的組織即為睪丸組織[15]。睪丸表面覆以漿膜及鞘膜臟層，深部為致密結(jié)締組織構(gòu)成的白膜，白膜在睪丸后緣增厚形成睪丸縱膈?？v膈的結(jié)締組織呈放射狀伸入睪丸實質(zhì)，將睪丸實質(zhì)分成約250個錐形小葉，每個小葉內(nèi)有1～4 條彎曲細長的生精小管。生精小管是由生精上皮構(gòu)成，生精上皮由支持細胞和5～8層生精細胞組成，生精細胞與支持細胞成圓柱形排列在生精小管的基膜上，毗鄰支持細胞的是血睪屏障，血睪屏障將生精小管分為兩個區(qū)，即基底部與管腔，在生精小管基底上有支持細胞、精原細胞與精母細胞。在生精小管的管腔中有初級精母細胞及其他不同分裂期的精細胞。

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)香煙暴露組大鼠睪丸組織出現(xiàn)明顯的損傷，隨著暴露時間的延長和暴露劑量的增加，曲細精管基底膜發(fā)生破裂，各級生精細胞排列紊亂甚至消失，出現(xiàn)大范圍空管樣的曲細精管，間質(zhì)細胞消失，間質(zhì)血管周圍出現(xiàn)中性粒細胞浸潤。香煙暴露組大鼠睪丸組織中的wnt-2b、β-catenin在mRNA和蛋白水平上均出現(xiàn)明顯下調(diào)，負性調(diào)控蛋白GSK-3β在mRNA和蛋白水平上均出現(xiàn)明顯上調(diào)，磷酸化β-catenin在蛋白水平上出現(xiàn)明顯上調(diào)。這說明香煙被動吸入抑制了wnt/β-catenin信號通路的激活，除直接抑制wnt-2b基因在mRNA和蛋白水平的表達外，還通過上調(diào)負性調(diào)控蛋白GSK-3β在mRNA和蛋白水平使睪丸組織中β-catenin發(fā)生磷酸化而降解，從而使進入細胞核內(nèi)促使生殖細胞發(fā)生分化、增殖作用的β-catenin減少，進而影響生殖系統(tǒng)的分化、增殖功能。綜上所述，我們的實驗結(jié)果表明香煙煙霧引起雄性大鼠生殖系統(tǒng)的損傷，而且這種改變可能和睪丸組織中下調(diào)的wnt/β-catenin信號通路有關。