占方玲 高思宇 謝元棟 張金銘 李毅 劉寧

摘?要?一價(jià)銅催化的疊氮炔基的特異性反應(yīng)通常被稱為“點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)”。點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)作為一種重要的分子連接方式，能夠在分子水平實(shí)現(xiàn)特定小分子基團(tuán)之間的簡(jiǎn)單高效連接。因其快速高效、選擇性高、條件溫和、副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中有廣泛應(yīng)用，包括新生成蛋白的鑒定和多種翻譯后修飾蛋白的鑒定等方面。因此，深入研究點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的反應(yīng)機(jī)制，對(duì)理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能具有重要意義。本文綜述了近年來點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的幾類重要應(yīng)用，并對(duì)其未來的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞?點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng);蛋白質(zhì)組學(xué);評(píng)述

1?引 言

蛋白質(zhì)組（Proteome）源于蛋白質(zhì)（Protein）與基因組（Genome）兩個(gè)詞的組合，這個(gè)概念最早是由澳大利亞Macquarie大學(xué)Wilkins等[1]提出。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要內(nèi)容包括在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模地分析組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間的相互作用等，從而揭示蛋白質(zhì)的功能，已在疫苗篩選、指導(dǎo)治療、臨床藥物開發(fā)及預(yù)后判斷等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[2，3]。

近年來，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，其利用合成化學(xué)方法生成小分子探針，揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。傳統(tǒng)的蛋白標(biāo)記探針主要有生物素、熒光基團(tuán)等，但普遍存在降低蛋白質(zhì)活性、對(duì)極性變化不夠敏感等缺點(diǎn)[4，5]。點(diǎn)擊化學(xué)的出現(xiàn)極大地降低了因探針摻入對(duì)蛋白活性的影響。點(diǎn)擊化學(xué)是指通過小分子基團(tuán)的拼接，簡(jiǎn)單高效地完成C-X-C雜原子化學(xué)合成的一類組合化學(xué)方法。目前，常用的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要包括銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（Copper-catalysed azide-alkyne cycloaddi-tion reaction，CuAAC）、直接促進(jìn)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC）、逆電子需求的 Diels-Alder反應(yīng)（Inverse electron demand Diels-Alder reaction，IEDDA）和施陶丁格鏈接反應(yīng)（Staudinger ligation）4類[6]。其中，CuAAC是較為經(jīng)典的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，該反應(yīng)是指由Cu+催化疊氮化合物與炔基化合物，生成三唑五元環(huán)化合物的共價(jià)加成反應(yīng)，如圖1所示。該方法反應(yīng)效率高，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和，具有很高的化學(xué)選擇性且不受水氧干擾、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[6]。近年來，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的結(jié)合在生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，特別是為新生成蛋白[7]、棕櫚酰化修飾蛋白[8]、糖基化修飾蛋白[9]及磷酸化修飾蛋白的檢測(cè)提供了方法，在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[10]、microRNA生物合成[11]和microRNA前體與蛋白質(zhì)相互作用[12]方面也有廣泛應(yīng)用。點(diǎn)擊化學(xué)的使用對(duì)探索蛋白質(zhì)生物學(xué)起到了巨大的推動(dòng)作用。本文對(duì)基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的幾類重要生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

2?新生成蛋白的檢測(cè)

蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，在正常和病理?xiàng)l件下，細(xì)胞會(huì)通過產(chǎn)生新生成蛋白對(duì)環(huán)境變化做出反應(yīng)，準(zhǔn)確檢測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)環(huán)境擾動(dòng)所做出的反應(yīng)對(duì)理解其潛在作用機(jī)制具有十分重要的意義。新舊蛋白質(zhì)共享相同的氨基酸庫(kù)，在生物學(xué)上難以區(qū)分，因此有必要對(duì)新生成蛋白進(jìn)行特殊標(biāo)記以進(jìn)行定性與定量分析。傳統(tǒng)標(biāo)記方法使用穩(wěn)定同位素氨基酸標(biāo)記法（Stable isotope labelling by amino acids in cell culture，SILAC） [13]比較擾動(dòng)前后蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。相較于極高豐度的原有蛋白質(zhì)，新生成蛋白質(zhì)常因豐度太低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在大多數(shù)質(zhì)量分析儀的定量動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的檢測(cè)[14]，因此SILAC對(duì)于測(cè)量蛋白質(zhì)合成的短時(shí)段內(nèi)變化并不是最佳的方法。已有研究發(fā)現(xiàn)了兩種非天然氨基酸疊氮高丙氨酸（Azidohomoalanine，AHA）和高炔丙基甘氨酸（Homopropargylglycine，HPG），它們可以在細(xì)胞的正常蛋白質(zhì)合成時(shí)摻入到該蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，并且無(wú)明顯細(xì)胞毒性[15，16]。生物正交非天然氨基酸標(biāo)記法（Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging，BONCAT，如圖2所示[17]）利用此特點(diǎn)，通過代謝標(biāo)記引入AHA或HPG[18，19]這種小分子基團(tuán)甲硫氨酸類似物。將被標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行裂解后，通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將帶有炔或疊氮化物的親和標(biāo)簽共價(jià)連接在目的蛋白上，再經(jīng)過親和素瓊脂糖凝珠對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化富集，最后將富集產(chǎn)物酶解成多肽，利用高通量質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[20，21]，可以選擇性富集新生成蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)新生成蛋白更深入的分析，從而促進(jìn)細(xì)胞間相互作用的生物學(xué)的研究發(fā)展。

該方法自建立以來，在動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析中得到廣泛應(yīng)用。Shen等[22]采用Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging （BONCAT）與MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)新生成蛋白在視覺條件時(shí)視神經(jīng)支配區(qū)急劇增加;作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Rab3家族成員中的突觸蛋白R(shí)ab3a、Rab3b和Rab3c受到視覺神經(jīng)的差異調(diào)節(jié)，在視覺刺激的頂蓋腦中Rab3b和Rab3c的表達(dá)量顯著增加，而Rab3a顯著減少，說明Rab3家族成員可能在體內(nèi)介導(dǎo)視覺依賴的行為可塑性中扮演不同的角色。Howden等[23]利用AHA標(biāo)記并結(jié)合了SILAC的方法（Quantitative non-canonical amino acid tagging，QuaNCAT），只需要標(biāo)記細(xì)胞數(shù)小時(shí)或喂食/注入動(dòng)物1～4天，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度新生成蛋白的定量分析。在該研究中，利用重同位素標(biāo)記的氨基酸對(duì)T細(xì)胞刺激后分泌的新生成蛋白進(jìn)行標(biāo)記，隨后通過親和素微珠對(duì)目的蛋白進(jìn)行富集，最后利用MS對(duì)新生成蛋白進(jìn)行了定量檢測(cè)。Ma等[24]的方法更簡(jiǎn)單直接，使用重同位素標(biāo)記的AHA（Heavy isotope-labeled azidohomoalanine quantification，HILAQ）進(jìn)行新生成蛋白的標(biāo)記，再通過點(diǎn)擊反應(yīng)添加生物素，接著對(duì)標(biāo)記的蛋白進(jìn)行沉淀洗滌和消化。該研究組對(duì)HT22細(xì)胞氧化模型的新生成蛋白進(jìn)行了定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)226種蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生了兩倍的變化，108種蛋白質(zhì)在細(xì)胞死亡途徑中得到富集，證明了HT22細(xì)胞作為一種分子工具，在研究神經(jīng)退行性疾病涉及的細(xì)胞凋亡的過程中十分有效。他們還將HILAQ法與QuaNCAT法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，HILAQ使用肽水平富集，已被證明是比QuaNCAT中使用蛋白質(zhì)水平富集的更靈敏的方法，且HILAQ法定量的新生成蛋白是QuaNCAT法定量的3.5倍以上。綜上，HILAQ方法是一種新型的新生成蛋白的定量檢測(cè)方法，通過使用重同位素的標(biāo)記簡(jiǎn)化了新合成蛋白質(zhì)組的分析過程，并且具有更高的靈敏度。崔秀雲(yún)等[25]首先利用脂多糖刺激Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α，然后通過代謝摻入AHA，并利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，使細(xì)胞中的新生成的蛋白標(biāo)記上生物素標(biāo)簽，再利用抗體對(duì)標(biāo)記蛋白進(jìn)行特異性捕獲，從而達(dá)到檢測(cè)特定的新生成蛋白的目的。該研究為檢測(cè)特定的微量新生成蛋白提供了一種可借鑒的方法。

除了上述AHA或HPG，一種非天然氨基酸對(duì)-疊氮-L-苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine，azF）也被用于蛋白質(zhì)的代謝標(biāo)記[26，27]。Smits等[28]開發(fā)了一種Click-MS的新型檢測(cè)方法，利用琥珀抑制技術(shù)選擇性地將琥珀終止密碼子（UAG）摻入到目的蛋白中，同時(shí)添加特定的tRNA和酰氨基-tRNA合成酶（aa-RS）。然后，通過無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)對(duì)摻入對(duì)-疊氮-L-苯丙氨酸的目的蛋白進(jìn)行特異性捕獲，最后利用質(zhì)譜檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)單個(gè)目的蛋白的選擇性富集。研究者利用此方法，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞粗提取物中特異性富集了兩種目標(biāo)蛋白： 信號(hào)轉(zhuǎn)錄與激活因子1（STAT1）和甲基CpG結(jié)合域蛋白3（MBD3）。與使用AHA或HPG的蛋白質(zhì)標(biāo)記策略有所不同，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)目的蛋白的特異性富集，對(duì)于揭示特定目標(biāo)蛋白的代謝情況以及與其它蛋白間的相互作用具有重要意義。

3?翻譯后修飾蛋白的檢測(cè)

3.1?棕櫚?；揎椀鞍椎臋z測(cè)

棕櫚?；揎椀鞍椎膫鹘y(tǒng)檢測(cè)方法是?；锼刂脫Q法 （Acyl-biotinyl exchange，ABE）[29]。 ABE法是先用碘乙酰胺封閉蛋白質(zhì)半胱氨酸上的自由巰基，利用羥胺選擇性地切割蛋白質(zhì)半胱氨酸和脂肪酸修飾基團(tuán)之間的硫酯鍵，再將帶有生物素的巰基特異性反應(yīng)活性試劑與新產(chǎn)生的自由巰基反應(yīng)，最后對(duì)目的蛋白S-棕櫚?；揎椀鞍走M(jìn)行純化、富集和檢測(cè)。已有研究采用ABE法對(duì)生物樣本中的棕櫚?；揎椀鞍走M(jìn)行了數(shù)量及修飾位點(diǎn)的鑒定分析[30，31]。盡管ABE法在檢測(cè)棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)方面有了很大進(jìn)展，但由于羥胺切割的是硫酯鍵，而不是S-棕櫚?；揎椀奶禺愇稽c(diǎn)，其它對(duì)羥胺敏感的硫酯鍵蛋白也有可能被同時(shí)富集[32]，因此存在假陽(yáng)性率高、靈敏度低、放射性強(qiáng)等缺點(diǎn)，極大限制了在棕櫚酰化修飾蛋白檢測(cè)方面的應(yīng)用。

近年來，研究者發(fā)展了另一種蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀姆治龇椒ǎ?化學(xué)報(bào)告基團(tuán)法（Chemical Reporter）[33]，該方法能夠區(qū)分S-脂肪?；ㄗ貦磅；揎棧┑牡鞍缀蚇/O-脂肪?；牡鞍?。與上述ABE法不同的是，該方法將含有炔基的棕櫚酸類似物代謝摻入細(xì)胞蛋白質(zhì)，然后通過點(diǎn)擊化學(xué)方法，選擇性地將帶疊氮基團(tuán)的生物素連接到標(biāo)記了炔基探針的蛋白質(zhì)上，接著使用羥胺對(duì)棕櫚酰化修飾蛋白的硫酯鍵處進(jìn)行特異性切割，最后采用抗生物素瓊脂糖凝珠對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行富集和鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)棕櫚?；揎椀鞍椎臋z測(cè)，如圖3所示。炔烴和疊氮化物脂肪酸探針通常都能有效標(biāo)記細(xì)胞脂肪酰化蛋白質(zhì)，其中炔基探針因具有較低的背景信號(hào)及更高的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用更為廣泛[34]。同時(shí)，添加一個(gè)疊氮基團(tuán)到脂肪酸鏈上可能會(huì)影響脂肪酸的疏水性，而炔基可保留脂肪酸碳鏈的疏水性，減少對(duì)脂肪酸物理化學(xué)性質(zhì)的改變及其與脂質(zhì)間的相互作用的影響[32]。Yount等[35]在吞噬細(xì)胞（鼠樹突狀細(xì)胞系）中使用Alk-C16進(jìn)行大規(guī)模棕櫚?；笀D譜分析，鑒定出157種具有多種功能，包括先天免疫的S-棕櫚?；鞍祝ㄆ渲?0個(gè)高可信度蛋白和97個(gè)中可信度蛋白）。他們研究發(fā)現(xiàn)棕櫚?；瘜?duì)于干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（IFITM3）的抗病毒活性至關(guān)重要，該蛋白在其膜上3個(gè)近半胱氨酸殘基（Cys71/72/105）處被棕櫚?；?。此外，Teo等[36]將基于點(diǎn)擊化學(xué)的探針用于分析感染單純皰疹病毒（HSV）的宿主細(xì)胞中的整體脂肪酰化，發(fā)現(xiàn)宿主S棕櫚酰化蛋白的一個(gè)子集（包括干擾素和四跨膜蛋白家族成員）被選擇性抑制，在感染過程中，很大一部分HSV蛋白均被S-棕櫚酰化。

3.2?糖基化修飾蛋白的檢測(cè)

蛋白質(zhì)的糖基化修飾是一種重要且常見的翻譯后修飾，占人類蛋白質(zhì)總量的一半以上，該修飾方式參與許多生理功能和生物學(xué)途徑[37]。在許多疾病中都能觀察到糖基化修飾蛋白的異常，如自身免疫性疾病、心血管疾病、阿爾茲海默癥和癌癥等[38，39]，因此對(duì)生理病理?xiàng)l件下的糖基化修飾蛋白進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)于理解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義。

點(diǎn)擊化學(xué)介導(dǎo)的糖基化蛋白的標(biāo)記（Glycoprotein labeling with click chemistry，GLCC）是一種常用檢測(cè)手段[40]。在這種方法中，含有生物正交功能基團(tuán)（如疊氮）的單糖類似物通過細(xì)胞自身的代謝機(jī)制摻入細(xì)胞的聚糖中，再利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將帶有生物素或熒光基團(tuán)的炔基標(biāo)記分子連接到糖基化蛋白上，最后通過鏈霉親和素瓊脂糖凝珠或熒光共聚焦顯微鏡成像對(duì)標(biāo)記分子進(jìn)行富集和檢測(cè)。目前，已有大量研究成功利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)對(duì)糖基化蛋白實(shí)現(xiàn)了可視化的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。Rong等[41]將疊氮作為化學(xué)報(bào)告基團(tuán)，代謝摻入到大鼠心臟組織中，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在疊氮上連接帶熒光基團(tuán)的炔基反應(yīng)試劑，最后通過熒光共聚焦顯微鏡成像鑒定出超過200種唾液酸修飾的心肌蛋白如T-kininogens等，并對(duì)唾液酸化的聚糖和O連接的聚糖進(jìn)行了高分辨率的成像分析，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在細(xì)胞與細(xì)胞間的連接處和T型管的細(xì)胞膜上。該研究還證明，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)介導(dǎo)的糖蛋白標(biāo)記在細(xì)胞水平、獨(dú)立的心臟器官水平和多肽水平都能實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，并成功進(jìn)行檢測(cè)（圖4）。其中，在細(xì)胞水平采用一價(jià)銅離子催化的點(diǎn)擊反應(yīng)將代謝摻入的疊氮糖與炔基熒光488分子相連接，通過熒光共聚焦顯微鏡成像進(jìn)行檢測(cè);在獨(dú)立心臟器官水平，對(duì)標(biāo)記了疊氮糖的心臟組織進(jìn)行Langendorff灌注，考慮到銅離子的生物毒性，研究采用的是不依賴于銅的DBCO-熒光488基團(tuán)標(biāo)記代謝摻入的疊氮糖，并對(duì)完整的心臟進(jìn)行熒光成像分析;在組織裂解液水平，將摻入了疊氮化物的心臟組織進(jìn)行裂解后，與炔基生物素進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，用鏈霉親和素富集唾液酸化的糖蛋白，然后進(jìn)行凝膠水平的蛋白鑒定。這些實(shí)驗(yàn)都證明了大鼠心臟糖原的體內(nèi)代謝標(biāo)記可使完整心臟組織中的心肌細(xì)胞表面聚糖可視化，并發(fā)現(xiàn)在獨(dú)立器官水平的心肌肥大模型小鼠的病理過程中，唾液酸化聚糖的生物合成上調(diào)，證明唾液酸化對(duì)心臟發(fā)育和發(fā)病機(jī)制存在潛在影響。Herber等[42]采用點(diǎn)擊反應(yīng)富集糖表面蛋白（Surface-spanning protein enrichment with click sugars，SUSPECS）方法，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞表面糖蛋白的富集、鑒定和定量分析。該研究先使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)選擇性標(biāo)記細(xì)胞表面糖基化修飾蛋白，而后通過對(duì)生物素的檢測(cè)，對(duì)糖基化修飾蛋白進(jìn)行高通量質(zhì)譜定量分析?；诿庖邿晒夤簿劢癸@微鏡顯示，SUSPECS選擇性標(biāo)記了細(xì)胞表面蛋白，在原代神經(jīng)元表面存在近700種跨膜糖蛋白。他們還將該方法應(yīng)用于治療阿爾茲海默病的關(guān)鍵藥物靶標(biāo)蛋白酶BACE1的研究中，發(fā)現(xiàn)BACE1通過抑制酶代謝，選擇性重塑了神經(jīng)元表面糖蛋白組，這種將點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與疾病關(guān)鍵藥物靶標(biāo)蛋白檢測(cè)相結(jié)合的手段對(duì)揭示阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。Song等[43]將含疊氮的AC4ManNAZ代謝摻入到細(xì)胞膜表面，利用銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)富集糖基化修飾蛋白，通過這種方式能夠去除豐度較高的胞質(zhì)蛋白，更好地表征細(xì)胞膜表面的糖基化修飾蛋白。Yang等[44]成功對(duì)前列腺癌細(xì)胞系中的唾液酸化糖蛋白進(jìn)行了鑒定。在非轉(zhuǎn)移性N2細(xì)胞系中觀察到36種細(xì)胞表面的糖蛋白，其中有8種糖蛋白參與細(xì)胞凋亡過程;在轉(zhuǎn)移性ML2細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)44種細(xì)胞表面的糖蛋白，其中有11種糖蛋白與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲有關(guān)。在上述與細(xì)胞侵襲有關(guān)的糖蛋白中，有6種糖蛋白不論是轉(zhuǎn)移性還是非轉(zhuǎn)移性均可用作生物標(biāo)記。該研究策略對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程的研究起到了極大的推動(dòng)作用。

目前，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)不局限于疊氮和炔基的反應(yīng)，還有一類新型的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)——硫醇和烯的特異性反應(yīng)[45]，在分子印跡技術(shù)標(biāo)記糖蛋白方面發(fā)展迅速。首先，分子印跡是一種在模板分子存在下制備特異識(shí)別聚合物的技術(shù)，因具有成本低且易于制備的優(yōu)點(diǎn)，被成功應(yīng)用于分子的分離和識(shí)別[46]。相比于以往熒光功能單體繁瑣的設(shè)計(jì)合成過程，新型分子印跡熒光傳感器的合成無(wú)需額外的熒光材料（量子點(diǎn)、碳點(diǎn)和熒光素等），只需通過簡(jiǎn)單的點(diǎn)擊反應(yīng)即可將普通的蛋白質(zhì)印跡聚合物轉(zhuǎn)變成一種新型的分子印跡熒光傳感材料，可應(yīng)用于生物大分子（如蛋白質(zhì)和多肽）的識(shí)別。Zhao等[47]利用該結(jié)合技術(shù)，將普通分子印跡聚合物升級(jí)為生物傳感器熒光傳感材料，成功實(shí)現(xiàn)了糖蛋白的快速檢測(cè)。他們使用含有二硫鍵的功能單體，在二硫鍵斷裂后，將暴露的硫醇基團(tuán)通過“硫醇-烯”的點(diǎn)擊反應(yīng)連接上帶有熒光特性和位點(diǎn)特異性識(shí)別的功能基團(tuán)。通過一步位點(diǎn)特異性反應(yīng)，不僅引入了與糖蛋白具有親和力的官能團(tuán)，還賦予了普通蛋白印跡聚合物良好的熒光特性（線性范圍為0.1～10 mg/mL），使普通蛋白印跡聚合物中功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)換更方便簡(jiǎn)單。

3.3?磷酸化修飾蛋白的檢測(cè)

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾，參與細(xì)胞的增殖分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝等生命活動(dòng)過程，是生物體內(nèi)最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一[48]。異常的磷酸化調(diào)節(jié)會(huì)導(dǎo)致許多嚴(yán)重的人類疾病[49]，對(duì)磷酸化修飾蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析有助于推進(jìn)疾病發(fā)病機(jī)制的研究。目前，常用的磷酸化修飾蛋白分離富集方法主要包括三類： 免疫沉淀法、親和色譜法和化學(xué)衍生法[50]。

近年來，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在磷酸化修飾蛋白的檢測(cè)方面也發(fā)揮了巨大作用。Akiba等[51]發(fā)現(xiàn)了一種帶正電荷的雙核Tb絡(luò)合物Tb2-L，該絡(luò)合物僅在磷酸酪氨酸存在下明顯發(fā)光，可用于選擇性地檢測(cè)磷酸酪氨酸（pTyr）。然而，當(dāng)多肽底物帶正電荷時(shí)，因存在靜電互斥作用，檢測(cè)靈敏度明顯降低。為克服此缺點(diǎn)，該研究組提出了一個(gè)更優(yōu)的方法，向Tb2-L分子中添加帶有炔基的基團(tuán)，生成一種新型的絡(luò)合物探針Tb2-Lc1yne;同時(shí)，向磷酸化多肽底物的半胱氨酸殘基上引入一個(gè)疊氮基團(tuán)，最后利用疊氮-炔基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)使絡(luò)合物探針與磷酸化的多肽底物實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。當(dāng)多肽底物被磷酸化時(shí)，基于鑭系元素發(fā)光的信號(hào)會(huì)發(fā)生明顯改變，從而實(shí)現(xiàn)酶促酪氨酸磷酸化蛋白的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在這項(xiàng)研究中，酪氨酸磷酸化肽段的信號(hào)可通過時(shí)間分辨光譜清晰地與背景區(qū)分開，易于進(jìn)行詳細(xì)的定量分析。綜上，該方法利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，只需將這種Tb絡(luò)合物添加到反應(yīng)混合物中，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸激酶的磷酸化和去磷酸化的實(shí)時(shí)監(jiān)控，是一種測(cè)定潛在蛋白激酶抑制劑的良好工具，對(duì)藥物開發(fā)的研究具有十分重要的推進(jìn)作用。

4?展 望

近年來，將點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與SILAC、BONCAT、分子印跡等方法相結(jié)合，為高通量質(zhì)譜法檢測(cè)蛋白質(zhì)提供了新思路。通過使用可發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)的探針，可對(duì)新生成蛋白和翻譯后修飾蛋白進(jìn)行可視化研究，并實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)的定性與定量檢測(cè)?？紤]到蛋白質(zhì)糖基化修飾和磷酸化修飾等翻譯后修飾在多種疾病中的關(guān)鍵作用，開發(fā)相應(yīng)的蛋白特異性識(shí)別探針至關(guān)重要。目前，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)僅在少數(shù)幾種類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中得到應(yīng)用，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)開發(fā)針對(duì)其它類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的特異性探針的研究將成為未來一個(gè)重要的研究方向。同時(shí)，對(duì)于蛋白質(zhì)標(biāo)記而言，目前僅針對(duì)甲硫氨酸開發(fā)了可直接進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)的小分子類似物，而針對(duì)其它種類的氨基酸篩選出一系列相應(yīng)類似物，將極大拓展點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)分析中的廣泛應(yīng)用。此外，銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)會(huì)帶來一定的生物毒性，因此，開發(fā)無(wú)毒高效的體內(nèi)新型點(diǎn)擊反應(yīng)仍然是未來點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。

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