許靜怡　陳超翔　韓錦艷　杭緯　顏曉梅

摘要 線粒體是細胞能量代謝、生物合成和細胞死亡的調(diào)控中心，其功能異常會導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究為解析線粒體的生理功能、探索線粒體相關(guān)疾病的發(fā)病機制及促進線粒體為靶向的藥物研發(fā)提供重要理論依據(jù)。本文對線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尤其是近年的技術(shù)發(fā)展以及線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用進行總結(jié)，并對其未來的發(fā)展前景和挑戰(zhàn)進行展望。

關(guān)鍵詞 線粒體； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 質(zhì)譜； 疾病； 評述

1 引 言

線粒體是真核細胞重要的細胞器，其在細胞能量代謝[1]、生物合成和細胞死亡[2，3]（包括細胞凋亡和細胞程序性壞死）的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。此外，線粒體還參與三羧酸循環(huán)、脂肪酸和氨基酸氧化、鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等重要生理過程[4]。由于線粒體在維持生命穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，因此其功能異常與許多人類疾病相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥、心臟病和糖尿病等[5～7]。由于線粒體蛋白質(zhì)表達異常是其功能紊亂的主要原因，而線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)正是從整體角度，分析線粒體的蛋白質(zhì)組成、表達水平與修飾狀態(tài)等的動態(tài)變化，旨在闡明線粒體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的表達模式和功能模式，包括蛋白質(zhì)的表達與存在方式（修飾方式）、結(jié)構(gòu)與功能、以及蛋白質(zhì)相互作用等，從而在蛋白質(zhì)水平探索線粒體生理功能和相關(guān)疾病的聯(lián)系[8，9]。通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)可系統(tǒng)研究正常和病變組織中線粒體蛋白分布與表達的差異，從而為研究線粒體相關(guān)疾病的分子機制和以線粒體為靶標(biāo)的藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)[10]。近年來，人類基因組測序的完成、串級質(zhì)譜和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展加速了線粒體蛋白組學(xué)的研究。本文對線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尤其是近年的技術(shù)發(fā)展進行總結(jié)，分析并討論蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用。

2 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法與技術(shù)

2.1 線粒體蛋白質(zhì)的提取策略

提取大量高純度的線粒體蛋白質(zhì)是開展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要前提[11]，線粒體的純度及其結(jié)構(gòu)的完整性是保障實驗結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵所在。如圖1所示，線粒體由外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)或者膜間隙蛋白質(zhì)組學(xué)可促進線粒體蛋白質(zhì)的定位和功能研究，但同時也對提取策略的選擇性和特異性提出了更高要求[12]。

差速離心結(jié)合密度梯度離心是分離純化線粒體的經(jīng)典方法[13]。差速離心用于分離不同大小、體積和重量的細胞器[14]。通過差速離心可初步分離得到線粒體，為盡量避免其它細胞器組分的干擾，需通過密度梯度離心對得到的線粒體進一步分離純化[15]。密度梯度離心是在離心管內(nèi)通過特定介質(zhì)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將差速離心得到的線粒體懸液置于介質(zhì)頂部，懸液通過重力或離心力場作用進一步分層和分離。線粒體密度梯度離心常用介質(zhì)有氯化銫、蔗糖、Ficoll、Percoll及碘化介質(zhì)（如Nycodenz）等。其中蔗糖黏度大且滲透性高， 易使細胞器破裂；而Percoll和Nycodenz介質(zhì)形成的梯度十分穩(wěn)定，且不易穿透生物膜造成細胞器損傷。例如，2010年Ferreira等利用Percoll為介質(zhì)的密度梯度離心法提取小鼠的腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維線粒體進行線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究[16]。2014年Chen等利用以Nycodenz為介質(zhì)的密度梯度離心法對卵巢癌中有阿霉素抗性與無阿霉素抗性的兩個細胞系分別提取線粒體，分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，122種蛋白質(zhì)在有阿霉素抗性的細胞系中表達量顯著變化[17]。提取線粒體的純度和完整性通常采用形態(tài)學(xué)觀察、特定抗體檢測或特定酶活性檢測等方法進行分析。電鏡可直觀地觀察線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的完整性，采用免疫印跡法分析線粒體標(biāo)志性蛋白如外膜VDAC、膜間隙細胞色素C蛋白的豐度可進一步證明膜結(jié)構(gòu)的完整性。此外，通過測定線粒體標(biāo)志性酶如琥珀酸脫氫酶的活性及與其它細胞器標(biāo)志酶的活性比較可檢測提取線粒體的純度。近年來，本課題組采用線粒體內(nèi)膜心磷脂特異性熒光探針（NAO）和核酸探針（SYTO 62）（與線粒體DNA結(jié)合）對線粒體進行標(biāo)記，利用其自行研發(fā)的超高靈敏流式檢測裝置（High sensitivity flow cytometer， HSFCM）在單顆粒水平對雙熒光標(biāo)記的線粒體進行檢測，通過散射光通道與兩個熒光通道信號的時間相關(guān)性可定量分析所提取線粒體的純度和結(jié)構(gòu)完整性并能從單細胞器水平揭示線粒體的異質(zhì)性[18]。

然而，通過上述分級分離技術(shù)獲得的線粒體蛋白不僅由于細胞器粘連導(dǎo)致純度較低，容易損失或受到污染，而且難以特異地檢測線粒體各個亞區(qū)間（基質(zhì)、膜間隙）的蛋白質(zhì)[11]。為了實現(xiàn)線粒體亞區(qū)間蛋白質(zhì)的特異提取，美國MIT大學(xué)的Ting課題組對抗壞血酸過氧化物酶（APEX）進行基因改造，可特異地“釣到”膜間隙或基質(zhì)蛋白質(zhì)[19]。如圖2所示，基因工程改造的APEX可靶向線粒體基質(zhì)、氧化多種苯酚衍生物產(chǎn)生羥基自由基，這些自由基壽命短（<1 ms）[20]，標(biāo)記半徑?。?lt;20 nm）[21，22]，可與富電子氨基酸例如Tyr， Trp， His等共價結(jié)合，從而標(biāo)記鄰近蛋白質(zhì)[23]。通過該方法可鑒定HEK細胞線粒體基質(zhì)的495種蛋白質(zhì)，其中31種是新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)[24]。采用該方法捕獲的基質(zhì)蛋白組覆蓋率和特異性分別達到85%和94%，覆蓋率較低的原因可能是一些蛋白質(zhì)側(cè)鏈被包埋太致密而無法與羥基自由基作用。該課題組又進一步通過APEX結(jié)合細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法（SILAC）[25] 提取和鑒定線粒體膜間隙蛋白組，共鑒定了127種膜間隙蛋白質(zhì)（其中9種蛋白為新發(fā)現(xiàn)的線粒體蛋白），特異性高達94%，實現(xiàn)了對線粒體膜間隙蛋白質(zhì)組的高效測定[26]。

圖2 標(biāo)記活細胞的線粒體基質(zhì)蛋白質(zhì)組[24]

Fig.2 Labeling the mitochondrial matrix proteome in living cells[24] （Adapted from Ref.[24]， with kind permission from Science）

綜上所述，獲得線粒體總蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法是采用差速離心結(jié)合密度梯度離心提取線粒體，裂解之后進行分離和質(zhì)譜分析，該提取策略促進了線粒體總蛋白質(zhì)“目錄”的建立。Ting課題組創(chuàng)新性地通過APEX與基質(zhì)或膜間隙靶向序列的融合表達，特異獲取線粒體基質(zhì)或膜間隙蛋白組，省略了提取細胞器這一繁瑣步驟，實現(xiàn)對線粒體亞區(qū)間蛋白質(zhì)的特異性提取和鑒定，促進了新蛋白的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的亞線粒體定位和亞區(qū)間蛋白質(zhì)功能研究，使蛋白質(zhì)組學(xué)邁入了 “細胞器亞區(qū)間”時代。

2.2 線粒體蛋白質(zhì)的分離策略

對于線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究，無論通過上述何種策略獲得線粒體蛋白質(zhì)組，都需要對蛋白質(zhì)混合物進行分離，分離后酶解成多肽片段，再通過質(zhì)譜進行鑒定。分離線粒體蛋白質(zhì)混合物的方法主要是電泳和色譜法。

二維電泳是分離線粒體蛋白質(zhì)最廣泛最經(jīng)典的方法，它是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。二維凝膠電泳的第一相常為等電聚焦電泳（IEF），根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同進行分離；第二相是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同進行分離。1998年Rabilloud等首先利用IEF/SDSPAGE分離人胚胎組織線粒體蛋白質(zhì)并結(jié)合肽指紋圖譜鑒定了46種線粒體蛋白質(zhì)[27]。王媛等通過雙向凝膠電泳在小鼠心臟、肝臟和腎臟3種組織中發(fā)現(xiàn)了87種組織特異的差異蛋白[28]。此外，有報道采用雙向熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）分析蛋白表達量的變化，即利用不同熒光染料標(biāo)記不同處理方法的蛋白質(zhì)，再等量混合標(biāo)記不同熒光染料的蛋白質(zhì)進行雙向電泳，通過熒光強度的變化可測定蛋白表達量的變化。如van Laar等提取小鼠腦線粒體并分成有無多巴胺醌處理的兩組，通過2DDIGE結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)18種蛋白質(zhì)的表達量發(fā)生顯著變化[29]。RamírezTorres等分別提取兩組膳食中“含”與“不含”鯊烯的小鼠肝臟線粒體，利用2DDIGE分離蛋白質(zhì)結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)鯊烯處理的小鼠肝臟線粒體中有18種蛋白質(zhì)表達量發(fā)生改變[30]。然而， IEF/SDSPAGE技術(shù)難以分離強酸性、強堿性、相對分子質(zhì)量過大或過小的蛋白質(zhì)或者膜蛋白和一些低豐度蛋白質(zhì)等。通過藍綠溫和非變性凝膠電泳（BNPAGE）結(jié)合SDSPAGE可以彌補IEF/SDSPAGE的技術(shù)缺陷，可分離線粒體膜蛋白復(fù)合物等。該技術(shù)是在非變性狀態(tài)下根據(jù)相對分子質(zhì)量分離膜蛋白復(fù)合體且不改變膜蛋白復(fù)合物的生理活性和結(jié)合狀態(tài)，再通過SDSPAGE將各個復(fù)合物的亞基或蛋白質(zhì)分離出來。Ferreira等通過綜合使用2DIEF/SDSPAGE/MS/MS和2DBN/SDSPAGE/MS/MS對腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維的線粒體蛋白質(zhì)進行分離和鑒定，識別325種線粒體蛋白質(zhì)[16]。Chou等綜合BN/SDSPAGE和IEF/SDSPAGE兩種分離方法對小鼠的大腦皮質(zhì)線粒體蛋白質(zhì)進行分離并結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)23種與三羧酸循環(huán)（TCA）相關(guān)蛋白質(zhì)在AD模型小鼠中表達失調(diào)[31]。

色譜是將線粒體蛋白質(zhì)用蛋白酶水解后，根據(jù)不同多肽在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使其在兩相間反復(fù)多次分配，以不同速度遷移，從而分離不同肽段。多維液相色譜組合了兩種或兩種以上不同分離機制，根據(jù)樣品不同特性（如分子大小、親水性、等電點等）對混合多肽進行分離。多維液相色譜具有快速、高通量、自動化、重現(xiàn)性高等優(yōu)點，且能夠檢測疏水性以及低豐度蛋白質(zhì)，但難以提供翻譯后修飾等信息[32]。

通過將凝膠電泳與色譜兩種策略以合理方式組合，可使混合物達到更好分離效果。即先將線粒體的蛋白混合物通過SDSPAGE分離并切割條帶水解成多肽，最后用一維或多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜來鑒定水解得到的肽段。例如，Techritz等從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎五種組織中提取線粒體并純化，通過IEF/SDSPAGE和LC/ESIMS及MS/MS分離鑒定，發(fā)現(xiàn)有48種蛋白質(zhì)在不同組織中存在不同表達程度[33]。

2.3 線粒體蛋白質(zhì)的鑒定

質(zhì)譜是鑒定蛋白質(zhì)的首選方法，其可以準(zhǔn)確測量肽段和蛋白質(zhì)的分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等信息。目前，根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽分子離子化的方式不同可分為電噴霧離子化質(zhì)譜（ESIMS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDIMS）。MALDI產(chǎn)生的離子可以用飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）檢測，即基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）。MALDITOFMS可以檢測肽段的分子量，獲得蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），通過與相應(yīng)的線粒體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對來鑒定蛋白質(zhì)[34]。此外，通過串級質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS）可對質(zhì)譜分析的肽段進行碎裂再用質(zhì)譜分析，從而得到肽段序列信息。質(zhì)譜技術(shù)還可與雙向凝膠電泳、二維液相色譜等蛋白質(zhì)或肽段分離技術(shù)聯(lián)用，實現(xiàn)“在線”式分離鑒定蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高和自動化程度高的優(yōu)點。如Taylor等通過蔗糖密度梯度法提取人心臟線粒體，利用SDSPAGE結(jié)合質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析，識別615種線粒體蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要參與生物合成，離子轉(zhuǎn)運及脂代謝[35]。Lamb等通過LCMS/MS發(fā)現(xiàn)40種以上線粒體蛋白質(zhì)在癌干細胞中表達量無限上調(diào)[36]。Mootha等通過串級質(zhì)譜技術(shù)LCMS/MS鑒定來自小鼠腦、心臟、腎、肝臟的399種線粒體蛋白質(zhì)[37]。但這些檢測到的大部分是高豐度蛋白質(zhì)，隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)靈敏度等的提高，也促進了低豐度蛋白質(zhì)的檢測。如Pagliarini等提取小鼠的14種組織結(jié)合MS/MS技術(shù)鑒定了3881種線粒體蛋白質(zhì)[38]。因為2DDIGE在樣品處理上費時費力，不利于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組定量，而通過同位素標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記（ICAT或iTRAQ）或label free方法，質(zhì)譜也可定量分析線粒體蛋白組的改變。例如，Bugger等通過label free方法和LCMS/MS發(fā)現(xiàn)心衰過程中脂肪酸氧化酶表達量減少，而丙酮酸脫氫酶亞基和兩種TCA循環(huán)關(guān)鍵酶表達量均上調(diào)，實現(xiàn)對線粒體蛋白組的定量分析[39]。為了探索氧含量對神經(jīng)元線粒體功能的影響，Villeneuve等分別提取5%和21%氧含量培養(yǎng)SHSY5Y（神經(jīng)母細胞瘤細胞）的線粒體，利用同位素標(biāo)記結(jié)合IEFPAGE及LCMS/MS分離鑒定蛋白質(zhì)，鑒定出714種線粒體蛋白質(zhì)，且5%氧含量培養(yǎng)的細胞的線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞基等顯著高于21%氧含量培養(yǎng)的細胞，前者所產(chǎn)生的活性氧水平也低于后者，說明SHSY5Y更適合在5%氧含量條件下培養(yǎng)[40]。線粒體蛋白質(zhì)的合成與降解過程之間的動態(tài)平衡是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要因素，因此Kim等通過重水標(biāo)記策略結(jié)合SDSPAGE， LCMS， MS/MS分離鑒定來自鼠心臟和肝臟485種“轉(zhuǎn)換蛋白質(zhì)”。實驗結(jié)果表明， 肝線粒體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換速率快于心臟組織，這些信息可以促進線粒體蛋白翻譯及穩(wěn)態(tài)維持的機理研究[41]。

顯微鏡技術(shù)是與質(zhì)譜互補的蛋白質(zhì)鑒定方法，其主要作用是對線粒體蛋白質(zhì)進行定位分析，即通過熒光標(biāo)記抗體或者轉(zhuǎn)染熒光蛋白（如GFP）等進行觀察，已成功運用于酵母菌的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究[42，43]。2013年Techritz等[33]從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎5種組織中提取線粒體，質(zhì)譜鑒定后再結(jié)合顯微鏡觀察GFP標(biāo)記的蛋白質(zhì)，識別了6種新的線粒體蛋白質(zhì)。該技術(shù)的缺陷在于高質(zhì)量抗體的數(shù)量和種類有限，轉(zhuǎn)染實驗周期較長且引入外源蛋白質(zhì)，只能對少量幾種蛋白進行觀察，無法實現(xiàn)高通量分析[44]。

總之，質(zhì)譜和顯微鏡技術(shù)的發(fā)展促進了線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，既可進行高通量分析，也可選擇性地觀察目標(biāo)蛋白，促進未知線粒體蛋白的發(fā)現(xiàn)，完善線粒體蛋白組的“目錄”，也使線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)在相關(guān)疾病的研究中得以應(yīng)用。

3 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的性質(zhì)及其應(yīng)用

隨著線粒體蛋白質(zhì)組提取、分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，目前已建立了較為完善的線粒體蛋白質(zhì)“目錄”。已檢測到1000多種人類線粒體蛋白質(zhì)[8]，并發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)的豐度變化非常大，最豐富的內(nèi)膜和外膜蛋白分別是ANT1和VDAC[45]。以下對線粒體蛋白質(zhì)組的蛋白數(shù)目、豐度、定位、翻譯后修飾、組織分布、生化途徑歸屬及其應(yīng)用進行介紹。

在線粒體蛋白質(zhì)的定位方面，一部分蛋白質(zhì)只存在于線粒體中，而另一部分線粒體蛋白質(zhì)可以“雙重”定位，即同一基因編碼的蛋白質(zhì)除了定位于線粒體，還出現(xiàn)在胞質(zhì)或其它細胞器中[46]。如在凋亡信號刺激下，tBID被凋亡蛋白酶8切割后轉(zhuǎn)位到線粒體外膜上[47]；線粒體膜間隙細胞色素C借助凋亡蛋白Bax等形成的孔道轉(zhuǎn)位到胞漿[48]。

在線粒體蛋白質(zhì)的翻譯后修飾方面，主要采用3種方式：乙?；?、磷酸化和羥基化。SIRT3是依賴NAD+的線粒體去乙?；?，為了解其作用底物，Rardin等利用Label free定量方法檢測到小鼠肝臟組織中483種乙?；€粒體蛋白質(zhì)，2187個賴氨酸乙?；稽c，且發(fā)現(xiàn)136種蛋白質(zhì)中283個乙?；稽c在SIRT3基因敲除小鼠模型中顯著上調(diào)，說明SITR3可對多種蛋白質(zhì)以及同一種蛋白質(zhì)上的多個位點去乙?；?。進一步分析發(fā)現(xiàn)， 這些乙?；€粒體蛋白質(zhì)主要參與脂肪酸氧化、TCA循環(huán)等，表明SITR3是一種廣譜的線粒體蛋白質(zhì)去乙?；竅49]。Grimsrud等通過對不同生理狀態(tài)小鼠肝臟磷酸化線粒體蛋白組進行多參數(shù)分析，結(jié)合iTRAQ定量標(biāo)記策略及LCMS/MS技術(shù)分離鑒定磷酸化多肽，共識別295種磷酸化線粒體蛋白質(zhì)，包括811個磷酸化位點，且這些線粒體蛋白質(zhì)的磷酸化在肥胖癥及T2D相關(guān)的酮體合成中起重要調(diào)節(jié)作用[50]。Deng等提取T2D模型小鼠的肝臟線粒體，通過LCMS/MS技術(shù)分離鑒定出355種羥基化線粒體蛋白質(zhì)，且羥基化程度在T2D病變過程中顯著提高，這種高程度的羥基化與ROS過量產(chǎn)生和氧化應(yīng)激相關(guān)，可加速凋亡速率，這些蛋白質(zhì)組學(xué)研究也促進了T2D發(fā)病機理探索和藥物研發(fā)[51]?？傊?，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與方法的發(fā)展促進動態(tài)可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。

在線粒體蛋白質(zhì)的組織分布方面，由于不同組織對線粒體的功能需求不同，如肝臟主要需要生物合成功能，而心臟主要需要能量代謝功能，因而線粒體蛋白質(zhì)在不同組織中分布不同。如Johson等分別提取小鼠的腦、肝臟、心臟和腎臟線粒體，通過LCMS鑒定識別1162種高信任度線粒體蛋白質(zhì)，然而任意兩種組織間有1149種蛋白質(zhì)顯著不同，4種組織中僅有13種蛋白質(zhì)相同，說明線粒體蛋白質(zhì)組的組織分布差異巨大[52]。Lotz等分別提取人心肌、小鼠心肌、小鼠肝臟組織及果蠅線粒體，利用SDSPAGE、LCMS/MS和光譜分析分別識別1398， 1620， 1733和1015種線粒體蛋白質(zhì)，4種體系中僅有419種蛋白質(zhì)高度保守，且這些蛋白質(zhì)表達量動態(tài)范圍大（跨越5個數(shù)量級），高豐度蛋白主要與氧化磷酸化、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白轉(zhuǎn)運等相關(guān)[53]。且研究發(fā)現(xiàn)，呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ和Ⅴ在所有組織中高豐度分布，然而復(fù)合物IV在不同組織中分布不同[54]。總之，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究揭示了線粒體蛋白質(zhì)在不同組織或種屬間分布差異大，不同組織的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以促進相關(guān)疾病的研究和治療。

在線粒體蛋白質(zhì)的生化途徑歸屬方面，以人的正常心臟組織為例（如圖3所示）[35]，在所識別的498種線粒體蛋白質(zhì)中，與氧化磷酸化功能相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)目最多，占17%，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的占12%，生物合成相關(guān)的占11%，與核苷酸代謝功能相關(guān)的數(shù)目最少，占1%，說明線粒體在能量代謝、生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的調(diào)控作用。

圖3 人心臟組織線粒體蛋白質(zhì)功能與分布[35]

Fig.3 Distribution and function of human heart mitochondrial proteins[35]

線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對線粒體相關(guān)疾病的研究起到了積極的推動作用。例如，線粒體氧化磷酸化受阻，將導(dǎo)致呼吸鏈疾?。≧CD），患病率約0.02%，臨床特征包含骨骼肌病變、心肌癥、癲癇、中風(fēng)、失明和內(nèi)分泌紊亂等，通過線粒體蛋白組學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)92種蛋白質(zhì)突變與RCD相關(guān)[55]。在退行性疾病方面，通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物I功能失調(diào)與帕金森疾?。≒D）相關(guān)，其參與蛋白折疊和細胞凋亡，促進了PD發(fā)病機制的研究[56]。在癌癥方面，Kim等在人胃癌細胞系A(chǔ)GS線粒體蛋白組研究中發(fā)現(xiàn)4種高表達的線粒體蛋白質(zhì)[57]；Chen等利用2DDIGE結(jié)合MALDITOFMS對不同的乳腺癌細胞系的線粒體蛋白組進行研究[58]，促進了腫瘤細胞線粒體生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。在心血管疾病方面，通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究可闡明壓力負荷誘導(dǎo)心衰[39]、缺血性心衰、以及慢性缺氧疾病的發(fā)病機制[59， 60]。在肝病方面，Eccleston等發(fā)現(xiàn)高脂肪膳食導(dǎo)致線粒體蛋白組改變，其與脂肪變性、NO合成及代謝有關(guān)[61]。在衰老方面，Alves等通過電泳和質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對有無運動的骨骼肌線粒體蛋白組研究，說明運動是改善衰老和維持線粒體功能的重要調(diào)節(jié)因素[62]。

在藥物研發(fā)方面，由于癌細胞抗藥性的產(chǎn)生使癌癥治療效果大大降低。Chen等通過SILAC和LCMS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)122種線粒體蛋白質(zhì)在對阿霉素抗性的卵巢癌細胞系中表達量顯著改變，分析表明線粒體是改善抗藥性的重要靶點[17]。Chappell等通過線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抗藥性細胞系中線粒體蛋白質(zhì)表達量的改變與凋亡規(guī)避、腫瘤侵染和轉(zhuǎn)移等生理活動相關(guān)[63]。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)也可用于藥物副作用的研究，Lee等通過iTRAQ定量并結(jié)合2DLC分離、MALDITOF/TOF MS/MS鑒定線粒體蛋白質(zhì)，說明曲格列酮會損傷線粒體功能[64]。綜上所述，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展促進了線粒體相關(guān)疾病的發(fā)病機制的系統(tǒng)研究和藥物研發(fā)。

4 結(jié)論與展望

隨著線粒體蛋白質(zhì)組提取、分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，目前既能對整個線粒體蛋白質(zhì)組進行分析，也可針對膜間隙或基質(zhì)亞區(qū)間蛋白質(zhì)組分析，進一步完善線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的“目錄”。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為我們提供了大量線粒體基因和蛋白信息，通過結(jié)合臨床特征，有利于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的基因和蛋白，為我們系統(tǒng)研究線粒體與人類疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)需要在以下幾個方向進一步發(fā)展：第一，進一步完善線粒體蛋白組目錄。一些蛋白質(zhì)可能由于豐度太低無法使用傳統(tǒng)方法檢測，一些蛋白質(zhì)由于側(cè)鏈包埋于封閉結(jié)構(gòu)中而無法對其進行生物素化檢測。因此需要改進實驗技術(shù)與方法，提高線粒體蛋白質(zhì)提取方法的覆蓋率和特異性，鑒定、識別之前難以檢測的蛋白質(zhì)；第二，除鑒定線粒體蛋白質(zhì)的氨基酸序列，還需完善蛋白質(zhì)翻譯后修飾和線粒體亞區(qū)間定位等信息，因為這些信息與蛋白質(zhì)自身功能緊密相關(guān)；第三，通過RNA干擾、蛋白蛋白相互作用、理論計算結(jié)合數(shù)據(jù)庫等方法研究蛋白質(zhì)在線粒體能量代謝、生物合成、細胞死亡中所起的作用（功能預(yù)測）；最后，借助生物及化學(xué)的新技術(shù)、新方法和數(shù)據(jù)庫資源等將線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白質(zhì)序列突變等信息與線粒體的生理功能和相關(guān)疾病的臨床特征及特定表型關(guān)聯(lián)起來，這不僅對于線粒體相關(guān)疾病發(fā)病機理的研究和藥物研發(fā)意義重大，而且也正是發(fā)展線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)的目的所在?？偠灾€粒體蛋白質(zhì)組學(xué)對線粒體全部蛋白質(zhì)的“破譯”將會為人類疾病研究和線粒體生物學(xué)開辟一個嶄新時代。

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