朱勇康 馬丹英 陸燕飛 尚林偉 趙遠(yuǎn) 張紫薇 尹建華

摘?要?關(guān)節(jié)滑液（SF）作為關(guān)節(jié)重要組分，在關(guān)節(jié)運動、潤滑、保護等方面起至關(guān)重要的作用。隨著骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)展，滑液內(nèi)蛋白、多糖等成分也會發(fā)生改變，因此可作為OA檢測的標(biāo)志物。常規(guī)拉曼光譜法檢測的靈敏度較低，難以實現(xiàn)對關(guān)節(jié)滑液內(nèi)微/痕量成分的光譜學(xué)檢測，因此，表面增強拉曼散射（SERS）技術(shù)成為微/痕量生物組織檢測的優(yōu)先選擇。本研究首先利用配制的銀納米溶膠檢測稀釋血清和透明質(zhì)酸（HA），以檢驗SERS技術(shù)用于關(guān)節(jié)滑液內(nèi)含物檢測的可行性，然后以患病早期（8周）OA犬類膝關(guān)節(jié)處滑液為實驗對象進行SERS檢測。結(jié)果表明，蛋白譜帶和HA、硫酸多糖等多糖譜帶的強度均明顯增強，實現(xiàn)了關(guān)節(jié)滑液的微量檢測分析。通過病變與健康關(guān)節(jié)滑液SERS光譜的對比分析發(fā)現(xiàn)，在OA早期，關(guān)節(jié)滑液中HA、硫酸多糖等多糖成分較健康滑液均呈現(xiàn)增加趨勢，并與健康關(guān)節(jié)滑液中對應(yīng)的相關(guān)譜帶有顯著性差異（p<0.05）。本研究將SERS技術(shù)用于關(guān)節(jié)滑液的檢測，取得了較為理想的實驗結(jié)果，為早期OA識別和病變規(guī)律的探究以及關(guān)節(jié)滑液等組織液的微/痕量檢測開辟了新的路徑。

關(guān)鍵詞?表面增強拉曼散射;關(guān)節(jié)滑液;多糖;骨關(guān)節(jié)炎

1?引 言

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是由于軟骨、滑膜、軟骨下骨、關(guān)節(jié)滑液等多種生化因素變化共同作用所導(dǎo)致的退行性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和活動受限，最終導(dǎo)致患者活動能力下降甚至喪失[1～3]。骨關(guān)節(jié)疾病早期缺乏癥狀，不易察覺，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時，多進入中晚期，軟骨已發(fā)生不可逆性損害[4]。因此，多數(shù)患者因為疼痛、關(guān)節(jié)功能喪失而不得不接受人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)[5]。現(xiàn)階段，骨關(guān)節(jié)炎的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢測，或以骨關(guān)節(jié)炎不同階段臨床表現(xiàn)及疼痛癥狀為診斷依據(jù)（慢性病史檢查），或以骨關(guān)節(jié)炎中后期出現(xiàn)的關(guān)節(jié)形態(tài)變化（如： 關(guān)節(jié)間隙顯著變窄、關(guān)節(jié)邊緣變尖、關(guān)節(jié)軟骨下骨形成骨性囊腔等）為診斷依據(jù)（X射線成像）[6]，或以骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時出現(xiàn)的軟骨及其下骨異變?yōu)樵\斷依據(jù)（計算機斷層掃描（CT），磁共振（MRI））[7]，但X線平片、CT檢查不能反映關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)變化，而MRI檢查存在檢測時間長、價格高、分辨率低等局限性。因此，探索骨關(guān)節(jié)炎早期的病變規(guī)律，開發(fā)在病變早期可及時診斷的方法十分有必要。

關(guān)節(jié)滑液（Synovial fluid，SF）是由水、蛋白質(zhì)、蛋白多糖（主要是糖胺聚糖GAGs）、脂質(zhì)、少量無機鹽及代謝物等成分構(gòu)成的生物體液，各成分在關(guān)節(jié)處發(fā)揮多種功能，如透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）作為未硫酸化的糖胺聚糖維持著關(guān)節(jié)滑液的粘彈性，并具有調(diào)節(jié)糖基化終產(chǎn)物、細(xì)胞因子和與OA相關(guān)酶生物活性的功能[8～10]。關(guān)節(jié)滑液作為關(guān)節(jié)軟骨與血液進行物質(zhì)交換的代謝通道，其中的組分會隨OA的發(fā)展而發(fā)生相應(yīng)的變化。在細(xì)胞因子水平研究中，已證實了滑液中硫酸軟骨素（Chondroitin salfate，CS）[11]、HA[12，13]、Ⅱ型膠原蛋白類[14，15]等成分均與OA進展具有相關(guān)性，但目前普遍使用酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）結(jié)合吸光度檢測的方法耗時長，步驟較為繁瑣，無法實現(xiàn)快速實時檢測[16]。

目前，對關(guān)節(jié)軟骨的光譜學(xué)研究主要采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）和拉曼散射技術(shù)（Stimulated Raman scattering，SRS）[17，18]，兩者主要對軟骨、脛骨等組織進行切塊/片檢測分析，但都存在對低濃度物質(zhì)檢測靈敏度低的缺陷。因為關(guān)節(jié)滑液中存在水，所以僅考慮拉曼光譜技術(shù)進行檢測。關(guān)節(jié)滑液在關(guān)節(jié)處含量少、濃度較低，常規(guī)自發(fā)拉曼技術(shù)難以進行微/痕量檢測。

液滴沉積法（Drop deposition，DD）是將液滴滴于固體基質(zhì)上，干燥并用于檢測的簡單方法[19]。結(jié)合拉曼檢測技術(shù)，可使弱散射性組分的拉曼信號得到改善[20，21]，在干燥過程中，干擾有效拉曼信號的雜質(zhì)（如熒光物質(zhì)等成分）會沉積于液滴中心處，而蛋白、多糖等大分子物質(zhì)會沉積于液滴邊緣，從而實現(xiàn)與檢測組分的“粗分離”[22～24]。

表面增強拉曼散射（Surface enhanced Raman scattering，SERS）技術(shù)的發(fā)展彌補了自發(fā)拉曼散射的不足，利用SERS基底金屬納米材料吸附檢測分子可以將待測物質(zhì)分子的檢測靈敏度提高若干個數(shù)量級，并在一定程度上減弱熒光背景，從而實現(xiàn)痕量檢測分析[25～29]。本研究通過滴加檸檬酸鈉加熱還原硝酸銀的方法制備銀納米溶膠，并利用液滴沉積法將其分別與血清、HA混合，進行拉曼光譜檢測，驗證了所制基底對蛋白、多糖等生物組分具有較好的增強效果。通過對比分析病變與健康SF的SERS光譜，發(fā)現(xiàn)病變SF中多糖成分（HA、硫酸多糖等）明顯增加，因而可作為OA（早期）檢測的潛在生物標(biāo)志物。

2?實驗方法

2.1?儀器、試劑與材料

FK-H2型磁力加熱攪拌器（上海越眾儀器公司）;CQ-600型超聲振蕩機（上海生析超聲儀器有限公司）;TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;LP8200P型電子天平（上海升隆電子科技公司）。

檸檬酸鈉（>99%）、AgNO3（>99.9%）均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）;HA（>99%，分析純，江蘇倍達(dá)醫(yī)藥科技有限公司）;實驗用水為二次去離子水。

選用成年比格犬（江蘇亞東實驗動物研究院實驗動物中心，動物實驗經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)）作為實驗對象，對其進行右后腿膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶造模術(shù)處理，培養(yǎng)8周后（即OA早期，由病理檢測及FTIR實驗證實[30]），用注射器抽取其4條腿膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)滑液，并加入適量生理鹽水，以滿足實驗用量。同期抽取該犬血液，不加入抗凝劑，靜置2 h后，以3000 r/min離心10 min，棄去紅細(xì)胞，取淡黃色上清液即血清，進行后續(xù)實驗。

2.2?銀納米溶膠的制備

采用檸檬酸鈉加熱還原AgNO3方法[31，32]制得銀納米溶膠，具體步驟如下： 將150 mL 0.1 mg/mL AgNO3溶液置于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，逐滴加入4 mL 1% （m/m）檸檬酸鈉溶液，并伴隨劇烈磁力攪拌，加熱攪拌60 min后停止加熱，繼續(xù)攪拌，冷卻至室溫，即得到初始銀納米溶膠;取適量溶膠于離心管內(nèi)，9000 r/min離心10 min，棄去上清液，并加入等量水，超聲振蕩5 min使其混合均勻，重復(fù)上述步驟，離心，超聲振蕩3次后，得到銀納米溶膠，用于后續(xù)實驗。

2.3?拉曼光譜采集

自行搭建的色散型拉曼光譜檢測系統(tǒng)[33，34]，由785 nm激光光源（IPS）、制冷型CCD檢測器（Andor）、外光路系統(tǒng)（收集系統(tǒng)）、計算機處理與顯示系統(tǒng)和光譜儀系統(tǒng)（光柵（Newport）刻痕密度1200 lp/mm，狹縫（Thorlab）50 μm組成。光譜采集范圍： 500～2200 cm1;分辨率： 3 cm1。制備10?4 mol/L（～0.04 mg/mL）HA溶液，此濃度明顯低于病理性關(guān)節(jié)滑液中HA濃度0.10～1.14 mg/mL[35]。用生理鹽水按1∶2（V/V）比例將血清稀釋;取約100 μL HA溶液、稀釋血清及實驗犬4組關(guān)節(jié)滑液，分別與等量銀納米溶膠混合，并設(shè)置對照組（不與銀膠混合的等量樣本），超聲振蕩5 min后，滴于氟化鋇晶片，于室溫條件下靜置約12 h，待其自然風(fēng)干。

分別采集HA、血清以及4組關(guān)節(jié)滑液液滴沉積風(fēng)干后的SERS光譜及對應(yīng)的自發(fā)拉曼光譜。共設(shè)置了6組實驗樣本共72個液滴沉積樣品，對每一液滴沉積邊緣繞一周檢測50～60處，并取其中增強效果明顯（即結(jié)合“熱點”區(qū)域）的20～30組拉曼數(shù)據(jù)作平均處理，以減小實驗誤差。背景扣除和光譜采集由CCD自帶Andor Solis軟件下完成，采用Vancouver Raman Algorithm軟件[36]對光譜進行熒光背景分離。上述各組的拉曼檢測實驗環(huán)境（室溫、干燥環(huán)境）均一致，其中各樣品的光譜檢測時間根據(jù)獲得較好的光譜效果的時間確定。血清的稀釋倍數(shù)不大，其在自發(fā)拉曼檢測中較短時間即可獲得較好效果的光譜，而由于HA和SF濃度極低導(dǎo)致自發(fā)拉曼信號很弱，需較長的積分時間檢測，因此稀釋血清的自發(fā)拉曼和SERS檢測時間均為10 s;稀釋HA自發(fā)拉曼檢測時間為60 s，SERS檢測時間為10 s;關(guān)節(jié)滑液自發(fā)拉曼檢測時間為60 s，SERS檢測時間為40 s。

3?結(jié)果與討論

關(guān)節(jié)滑液作為關(guān)節(jié)軟骨組織與血液進行物質(zhì)交換的通道，本質(zhì)上屬于血漿透析液，各蛋白組分與血清中基本一致[37]。目前HA已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞因子水平研究中[8～10]。由于其中各生物組分的光譜重疊，為探究具體的增強成分，分別制備了稀釋血清及HA溶液作為實驗對象，以探究關(guān)節(jié)滑液SERS檢測的可行性。

3.1?血清及HA的SERS檢測

將稀釋血清自發(fā)平均拉曼光譜與增強平均拉曼光譜對比，由圖1A可見，SERS光譜在709、742、830、894、950、1002、1090、1130、1207、1230～1280（amide Ⅲ）、1446、1646 cm?1等處各峰強度明顯增強，所測得的血清拉曼特征峰與文獻(xiàn)[38，39]一致。其中，增強的譜帶主要歸屬于血清中各種蛋白氨基酸，表明所制備的銀納米溶膠對血清中各蛋白組分有較好的增強效果。

0.1 mmol/L HA的拉曼光譜與SERS光譜對比如圖1B所示，自發(fā)拉曼光譜中各特征峰強度極弱，并且部分峰因出現(xiàn)疊加情況而無法分辨，而SERS光譜在890、1001、1150、1270、1340和1490 cm?1等處的峰強度有～102數(shù)量級的增強。盡管在不同實驗條件下各特征峰位置會發(fā)生2～10 cm?1的偏移，但實驗所測各特征峰與文獻(xiàn)[40]中基本一致。此外，通過對比檢測時間及光譜各譜帶效果可知，與自發(fā)拉曼光譜相比，SERS具有快速、高效、高信噪比等優(yōu)勢[41]。

上述結(jié)果表明，所制備的銀納米溶膠對血清和HA的拉曼譜峰明顯增強。血清中增強的各譜帶主要是各種蛋白質(zhì)的譜峰，而關(guān)節(jié)滑液中也含有這些蛋白，只是關(guān)節(jié)滑液中蛋白的成分含量約是血清中的1/5[37]。對稀釋后的HA的SERS檢測結(jié)果表明，888和962 cm?1（醇類OH伸縮振動）、1269 cm?1（CN伸縮振動）、1450和1498 cm?1（CH2/CH3發(fā)生形變或彎曲）等譜帶明顯增強，而HA是關(guān)節(jié)滑液的主要成分，因此，基于本研究制備的SERS基底對關(guān)節(jié)滑液等生物組織液的檢測是可行的，HA可作為SERS檢測OA的潛在生物標(biāo)志物。并且所制備銀溶膠對HA這種多糖成分增強效果明顯優(yōu)于各蛋白組分，這可能是多糖成分更易與銀納米粒子結(jié)合形成“熱點”區(qū)域而得到增強（即SERS基底具有選擇性和特異性[26，42]）。因此，本實驗在對關(guān)節(jié)滑液進行檢測分析時，以各多糖譜帶研究為主，對OA早期階段關(guān)節(jié)滑液內(nèi)各多糖組分的變化規(guī)律進行探究。

3.2?關(guān)節(jié)滑液自發(fā)拉曼光譜分析

首先對OA造模培養(yǎng)8周（OA早期）的實驗犬4條腿膝關(guān)節(jié)處關(guān)節(jié)滑液進行自發(fā)拉曼光譜檢測。圖2為手術(shù)側(cè)（右后腿）關(guān)節(jié)滑液自發(fā)平均拉曼光譜，結(jié)合表1中關(guān)節(jié)滑液主要糖帶Raman譜峰可知，1處糖帶峰較為明顯，而其余幾處不明顯且強度都很弱，不適于于進行分析對比。

考慮到犬類前后腿健壯程度差異較大，選擇右后腿SF（手術(shù)側(cè)）和左后腿SF（手術(shù)對側(cè)）進行對比分析較為合適。但實驗犬在右后腿進行OA造模后，在日?；顒又锌赡軙棺蠛笸瘸惺芨髩毫?，從而使其關(guān)節(jié)磨損過度出現(xiàn)OA癥狀，因此有必要探究實驗犬左后腿是否健康。

實驗犬左前與右前腿健康膝關(guān)節(jié)滑液自發(fā)平均拉曼光譜對比如圖3A所示，雖然各峰強度不強，但898、940、1160和1204 cm?1等主要糖帶峰差異不大（各峰p>0.05，無顯著差異性）。實驗犬健康（左前腿）關(guān)節(jié)滑液與手術(shù)對側(cè)（左后腿）關(guān)節(jié)滑液自發(fā)平均拉曼光譜如圖3B所示，除1000～1180 cm?1之間各譜帶強度太低，無法用于對比分析外，兩者在898、940和1206 cm1處主要糖帶峰基本重合（即圖3B中圈出部分，p>0.05，無明顯差異性），說明實驗犬手術(shù)對側(cè)膝關(guān)節(jié)滑液仍然健康，即在OA早期（8周），實驗犬可能為適應(yīng)身體狀況而減少活動量，所以手術(shù)對側(cè)左后腿膝關(guān)節(jié)磨損受壓程度還未生成OA，這與病理解剖結(jié)果[30]一致。因此，可以將手術(shù)對側(cè)與手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)滑液進行對比分析。手術(shù)側(cè)（右后腿）與手術(shù)對側(cè)（左后腿）關(guān)節(jié)滑液自發(fā)平均拉曼光譜如圖3C所示，兩者在901、940和1206 cm?1處譜峰有差異，但只有1206 cm?1處表現(xiàn)出明顯差異性（p<0.05）;而1080、1160、1206和1370 cm?1處各糖帶峰強度弱，無法充分利用光譜信息進行分析，即關(guān)節(jié)滑液常規(guī)的自發(fā)拉曼光譜檢測無法滿足需求。因此，有必要結(jié)合SERS技術(shù)對關(guān)節(jié)滑液進行微/痕量增強檢測。

3.3?關(guān)節(jié)滑液SERS分析

手術(shù)對側(cè)（左后腿）膝關(guān)節(jié)滑液自發(fā)拉曼與SERS對比如圖4所示，所制備銀納米溶膠對關(guān)節(jié)滑液的拉曼光譜信號有明顯的增強作用，特別是902、934、1068、1130、1208和1377 cm?1等處多糖譜帶信號強度較自發(fā)拉曼光譜提升了約100倍，因此可以充分利用光譜中各糖帶信息進行對比分析。

并出現(xiàn)了較大的差異，OA早期關(guān)節(jié)滑液與健康關(guān)節(jié)滑液之間多糖成分含量具有顯著差異性（p<0.05），即在手術(shù)側(cè)OA早期關(guān)節(jié)滑液中各多糖含量相較于手術(shù)對側(cè)正常關(guān)節(jié)滑液中多糖含量有所增加。這可能是因為在OA早期軟骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變之前軟骨內(nèi)部代謝已出現(xiàn)異常，HA、硫酸多糖等多糖成分開始出現(xiàn)流失或吸收減少，從而進入到了作為物質(zhì)代謝通道的關(guān)節(jié)滑液內(nèi)，導(dǎo)致了早期OA關(guān)節(jié)滑液中多糖含量增加，這也與在早期OA中軟骨內(nèi)多糖成分減少的相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論吻合[43]。結(jié)合圖4和圖5關(guān)節(jié)滑液的自發(fā)及SERS光譜可知，在自發(fā)拉曼光譜中，以1001 cm?1（蛋白質(zhì)，苯丙氨酸）為代表的各蛋白氨基酸特征峰強度明顯強于各主要糖帶峰，且1001 cm?1處強度最強;SERS光譜中，1026和1126 cm?1等各多糖帶增強效果相較于蛋白組分更明顯，這與3.1節(jié)中對稀釋HA和血清的SERS檢測結(jié)果一致，進一步驗證了所制備銀納米溶膠用于關(guān)節(jié)滑液檢測的可行性，其中多糖組分的增強效果較好。

4?結(jié) 論

以關(guān)節(jié)滑液為研究對象，結(jié)合SERS技術(shù)，利用液滴沉積法對OA早期關(guān)節(jié)滑液中成分變化進行了探究，發(fā)現(xiàn)在OA早期，病變關(guān)節(jié)滑液中硫酸多糖、HA等多糖成分呈現(xiàn)增加趨勢。在OA早期，特別是在結(jié)構(gòu)發(fā)生改變之前，快速準(zhǔn)確的診斷并及時治療是骨關(guān)節(jié)炎診斷治療的難點。目前，常規(guī)拉曼或紅外光譜可以實現(xiàn)軟骨成分變化快速檢測，但難以實現(xiàn)無創(chuàng)或微創(chuàng)的臨床要求。本研究將SERS技術(shù)應(yīng)用于關(guān)節(jié)滑液研究，實現(xiàn)了對關(guān)節(jié)滑液的微量檢測，并初步探究了OA早期病變的規(guī)律，為早期OA病變規(guī)律的探究提供了新思路，也為OA的無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷提供了新方法。

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