王 曈，萬佳宏，常佳偉，魏彥琴，馬 強，楊 敏，梁思慧，王玉霞，王桂琴

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

腸球菌(Enterococcus)是一種兼性厭氧性革蘭陽性菌，屬于人和動物腸道內(nèi)的共生細(xì)菌，現(xiàn)已成為主要的機會致病菌[1]。在腸球菌屬中，糞腸球菌和屎腸球菌可導(dǎo)致人類和動物的許多感染，如心內(nèi)膜炎，敗血癥等[2]。據(jù)報道，腸球菌可引起某些動物的感染，如犢牛腹瀉[3]、仔豬關(guān)節(jié)炎[4]、羔羊腦炎[5]等，對養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)80年代以來，隨著耐萬古霉素腸球菌(VRE)的出現(xiàn)，腸球菌耐藥菌株不斷增加，對腸球菌耐藥性的研究越來越受到關(guān)注。

寧夏地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，然而隨著該地區(qū)奶牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，濫用抗生素現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，導(dǎo)致腸球菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和人類健康帶來潛在危害。為了了解寧夏地區(qū)牛源腸球菌的耐藥性及耐藥基因和毒力基因的攜帶情況，本試驗對寧夏地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場分離的腸球菌進(jìn)行了抗菌藥物的敏感性試驗及相關(guān)耐藥基因與毒力基因的檢測，以期掌握寧夏地區(qū)牛源腸球菌的耐藥情況，為指導(dǎo)奶牛場臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源255株腸球菌試驗菌株為2016-2018年從寧夏地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖牛場奶牛肛門拭子分離鑒定并收集。腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29212，購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 主要試劑與儀器BHI肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、6.5%NaCl營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MH(A)瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限公司；腸球菌顯色培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、溶菌酶、溶葡萄球菌素及PCR相關(guān)試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；16種藥敏紙片購自O(shè)xoid公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272)購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；自動立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠；移液器與小型臺式離心機購自Eppendorf公司；電熱恒溫干燥箱(DGF25012C)購自重慶華茂儀器有限公司；PCR擴增儀(Veriti)購自Applied Biosystems公司；電泳儀購自北京市六一儀器廠；全自動凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.3 腸球菌的初步分離鑒定將采集的奶牛肛門拭子低溫帶回實驗室，樣品在6.5%NaCl營養(yǎng)肉湯中45℃、18～24 h預(yù)增菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物接種在腸球菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察顯色培養(yǎng)基上菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取經(jīng)初步分離鑒定的腸球菌DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 腸球菌的PCR鑒定參考文獻(xiàn)[6-7]，合成腸球菌屬、糞腸球菌、屎腸球菌的引物，引物信息見表1，引物均由上海生工有限公司合成。25 μL總反應(yīng)體系為：混合酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模版1 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72℃延伸30 s，共29個循環(huán)；72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，110 V電壓電泳20 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。將PCR電泳產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，送至上海生工有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過NCBI上的BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.6 抗菌藥物敏感性測定根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的藥敏紙片瓊脂擴散法(K-B法)測定255株腸球菌對16種抗菌藥物的敏感性，以ATCC29212為質(zhì)控菌株，結(jié)果判定嚴(yán)格根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 耐藥基因的檢測參考文獻(xiàn)[8-9]合成tetM、VanA、VanB、VanC、fexA、ermB、Aac(6)′aph(2)″、aph(3)′-Ⅲ、ant(6)′-Ⅰ引物，引物信息見表1。20 μL總反應(yīng)體系為：混合酶7.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模版2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72℃延伸30 s，共27個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳、純化回收，送至上海生工有限公司進(jìn)行測序及分析。

1.8 毒力基因的檢測參考文獻(xiàn)[10-11]合成毒力基因acm、agg、clyA、efaA、esp、fsr、gelE的引物，引物信息見表1。反應(yīng)體系及條件同1.7。

表1 相關(guān)基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 腸球菌鑒定結(jié)果腸球菌在顯色培養(yǎng)基上呈紫紅色，表面光滑的小菌落(圖1)，鏡檢形態(tài)呈球形，鏈狀排列。經(jīng)PCR鑒定，共分離鑒定出腸球菌255株，其中屎腸球菌(圖2)有78株(30.59%)，糞腸球菌(圖3)有53株(21.96%)，其他種類腸球菌124株，占比48.63%。

圖1 腸球菌在顯色培養(yǎng)基上的形態(tài)

圖2 糞腸球菌PCR電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；N.陰性對照；1～4.檢測菌株

2.2 藥敏試驗結(jié)果255株腸球菌對16種抗菌藥物的耐藥情況見表2。由表2可見，本地區(qū)腸球菌耐藥情況較為嚴(yán)重，分別對屎腸球菌、糞腸球菌的耐藥率進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌和糞腸球菌的耐藥率與總體耐藥率基本一致，其中屎腸球菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、利奈唑胺的耐藥率高于糞腸球菌對其的耐藥率，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，屎腸球菌與糞腸球菌的耐藥率并無顯著差異(P>0.05)。對腸球菌多重耐藥情況的統(tǒng)計結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，寧夏地區(qū)牛源腸球菌多重耐藥情況比較嚴(yán)重，其中五耐和六耐居多，占比超過50%。沒有對所有藥物敏感的菌株，最少的耐2種藥物，最多對耐13種藥物均耐藥，多重耐藥菌株占98.82%。

圖3 屎腸球菌PCR電泳圖 M.DL2000 DNA Marker；N.陰性對照；1～3.檢測菌株

表2 255株腸球菌對16種抗菌藥物的耐藥情況

圖4 腸球菌多重耐藥情況

2.3 腸球菌分離株耐藥基因PCR檢測結(jié)果255株腸球菌耐藥基因攜帶情況見表3。結(jié)果顯示，氨基糖苷類耐藥基因aph(3)′-Ⅲ、aac(6)′/aph(2″)、ant(6)′-Ⅰ的檢出率最高，分別為100%、94.90%和82.35%；其次是紅霉素類耐藥基因ermB，檢出率為46.27%，四環(huán)素類耐藥基因tetM的檢出率為25.49%，未檢出耐萬古霉素耐藥基因VanA、VanB和VanC。

表3 255株腸球菌耐藥基因檢出結(jié)果

2.4 腸球菌分離株毒力基因PCR檢測結(jié)果255株腸球菌毒力基因攜帶情況見表4。由表4可見，毒力基因明膠酶gelE的攜帶率最高，為37.60%，其次為心內(nèi)膜炎抗原efaA，檢出率為36.10%，其余毒力基因的檢出率在9%～21%。

表4 255株腸球菌毒力基因檢出結(jié)果

3 討論

本試驗結(jié)果顯示，從寧夏地區(qū)分離的255株牛源腸球菌的耐藥水平較高，其中最少的耐2種藥物，最多的已經(jīng)耐13種藥物，耐藥情況較為嚴(yán)重。其中，該地區(qū)牛源腸球菌對紅霉素的耐藥率為65.92%，低于候書寶等[12]報道的牛源腸球菌對紅霉素耐藥率98.4%；而對四環(huán)素的耐藥率與候書寶等[12]報道的結(jié)果較為接近； BARLOW等[13]報道的分離自澳大利亞地區(qū)牛源腸球菌對四環(huán)素和紅霉素的耐藥率分別為13.0%和13.6%，這與本地區(qū)牛源腸球菌對這2種藥的耐藥率有較大差異，原因可能是不同地區(qū)用藥水平不同，寧夏地區(qū)對該藥用藥頻率較高，導(dǎo)致細(xì)菌的選擇壓力增大，因此耐藥率高于澳大利亞地區(qū)。李金磊等[14]報道的河南地區(qū)雞源與豬源腸球菌對青霉素的耐藥率分別為100%和69.59%，均高于本地區(qū)牛源腸球菌對青霉素的耐藥率56.86%，這是因為不同動物的用藥習(xí)慣不同，并且奶牛場用藥相對較少，導(dǎo)致不同動物源細(xì)菌對同種藥物的耐藥率差異較大。

將寧夏地區(qū)牛源腸球菌耐藥基因型與毒力基因型的檢測結(jié)果與侯書寶等[12]、鄧立新等[15]和高昇等[16]的相關(guān)基因檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)基因的檢出率存在差異，說明不同地區(qū)的腸球菌存在著種間差異，攜帶的基因也不盡相同。耐藥基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)氨基糖苷類耐藥基因攜帶率較高，均在80%以上，但對氨基糖苷類藥物慶大霉素的耐藥率為54.51%，慶大霉素的耐藥表型與其基因型不一致，這說明該地區(qū)腸球菌可能還有其他的耐藥基因或耐藥機制[17]。本試驗中，牛源腸球菌對紅霉素的耐藥率(65.88%)和其相關(guān)耐藥基因ermB的檢出率(46.27%)較高，表明菌株對紅霉素的耐藥比較嚴(yán)重，而ermB基因編碼紅霉素甲基化酶，能夠使紅霉素對細(xì)菌的作用靶位發(fā)生改變，從而對大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥[18]。因此，在該地區(qū)選擇臨床用藥時，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇該藥。

由gelE基因編碼的明膠酶，能酶解宿主細(xì)胞中的膠原蛋白，使腸球菌易感染宿主。esp基因則與細(xì)菌形成生物被膜相關(guān)[19]。HAMMERUM等[20]報道的丹麥地區(qū)豬源腸球菌esp基因攜帶率為8%，而人源腸球菌esp基因攜帶率為41.70%，而在本試驗中，esp基因的檢出率為19.60%，低于該地區(qū)人源腸球菌但高于豬源腸球菌該基因的攜帶率。黃奕雯等[21]報道，江西地區(qū)豬源腸球菌gelE基因攜帶率為58.74%，高于本地區(qū)牛源腸球菌的攜帶率37.60%。在不同動物之間，毒力基因普遍存在[22]，而不同地區(qū)或不同動物源所攜帶的毒力基因比例存在差異。

近些年來，牛場為了預(yù)防某些疾病，選擇使用抗菌藥，其中不乏濫用抗菌藥現(xiàn)象的存在，那些對抗菌藥耐藥的細(xì)菌(AMR)，可以通過多種途徑傳播給人類，如通過食物或直接接觸動物[10,23]，對人類的健康存在威脅。從本試驗研究結(jié)果來看，寧夏地區(qū)腸球菌多重耐藥結(jié)果不容樂觀，對磺胺異噁唑、桿菌肽、紅霉素和四環(huán)素耐藥情況非常嚴(yán)重，因此，在臨床選擇用藥上，應(yīng)避免使用這些耐藥率高的藥物，選擇使用耐藥率較低的藥物，避免長期使用同種藥物，造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。在寧夏地區(qū)應(yīng)做好耐藥性監(jiān)測工作，通過藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)牛場合理用藥，盡量減少抗菌藥物的使用，減少耐藥基因的傳播。