黃怡穎，張 健

(海安市人民醫(yī)院檢驗科,江蘇海安 226600)

急性缺血性腦卒中(AIS)是腦卒中的最常見類型之一，其特點為高患病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-3]。但是目前尚未研發(fā)出特效藥物對AIS進(jìn)行有效治療和控制，因此，深入探索及研究AIS具有重要的臨床意義和診斷價值。微小RNA(miRNA)是一類小的單鏈調(diào)節(jié)RNA，其通過調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)從而廣泛參與轉(zhuǎn)錄后的生物過程[4-6]。超過60%的人類蛋白質(zhì)編碼基因含有至少一個保守的miRNA結(jié)合位點，大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因受miRNA調(diào)控[7-8]。近年來已有大量研究證實，AIS患者的病理過程可與血清miRNA的表達(dá)密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[9-11]。本研究通過對比健康人群和AIS患者血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平，探索三者在AIS患者中的臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2017年4月至2018年4月AIS患者50例為病例組。病例組男28例，女22例；平均年齡(52.3±5.8)歲；高血壓患者22例，糖尿病患者14例，高血脂患者20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者符合全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修正的《各類腦血管疾病診斷要點》中AIS中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，同時經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實。(2)計算美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分，評分范圍：0～1分為正常或近乎正常；>1～4分為輕度卒中/小卒中；>4～15分為中度卒中；>15～20分為中重度卒中；>20～42分為重度卒中。同時選擇本院同期非AIS患者50例作為對照組，并且與病例組年齡、性別等相匹配，排除腦卒中病史、頭部手術(shù)史等疾病。對照組男25例，女25例；平均年齡(55.1±7.5)歲；高血壓患者18例，糖尿病患者16 例，高血脂患者 23 例。2組患者年齡、性別及疾病史方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究已經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集 所有受試者的血液標(biāo)本均在空腹?fàn)顟B(tài)下采集，將受試者的靜脈血3～5 mL收集裝進(jìn)試管中，離心后，將獲取的血清置于-20 ℃冰箱保存，凍存檢測樣本以備后續(xù)實驗檢測。

1.3檢測方法 血清miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平均采用實時災(zāi)光定量PCR(RT-PCR)進(jìn)行檢測，試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司。所有實驗操作均嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR測量儀購自德國Qiagen公司，小型高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。首先，提取血清中總RNA，采用去除基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將待測標(biāo)本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR進(jìn)行檢測。反應(yīng)溶液為20.0 μL體系，分別為SYBR GREEN Mix 8.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA 4.0 μL，最后加入無RNA酶水6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，采用38個循環(huán)。miRNA-17-5p的上游引物序列為5′-CCA GGA TCC TTT ATA GTT GTT AGA GTT TG-3′,下游引物序列為5′-CGG AAT TCT AAT CTA CTT CAC TAT CTG CAC-3′。miRNA-103-3p的上游引物序列為5′-GAG CAG CAT TGT ACA G-3′,下游引物序列為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。miRNA-144-3p的上游引物序列為5′-GGC GTA CAG TAT AGA TGA T-3′,下游引物序列為 5′-GAG CAG GCT GGA GAA-3′。β-actin的上游引物序列為5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′,下游引物序列為 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。本實驗的研究結(jié)果均采用2-ΔΔCt法換算三者的相對表達(dá)量。

表1 2組患者的臨床基線資料比較

2 結(jié) 果

2.12組血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的表達(dá)水平比較 與對照組相比，病例組血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

2.2血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平與AIS臨床特征間的相關(guān)性 相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p與AIS患者NHISS評分呈顯著正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.605，P=0.000；r=0.667，P=0.000；r=0.710，P=0.000)。見表3。

表2 2組患者血漿中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p與miRNA-144-3p表達(dá)水平比較

表3 血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平與NHISS評分相關(guān)性

圖1 miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者聯(lián)合對AIS的ROS曲線

表4 miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者聯(lián)合檢測ROC曲線下面積

2.3ROC曲線分析 采用ROC曲線評價血清miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者聯(lián)合對AIS的診斷價值，結(jié)果提示miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者聯(lián)合區(qū)分AIS患者與非AIS的曲線下面積分別為0.846(95%CI：0.757～0.935，P=0.000)、0.866(95%CI：0.788～0.945，P=0.045)、0.935(95%CI：0.888～0.982，P=0.001)和0.976(95%CI：0.953～0.999，P=0.000)；靈敏度和特異度分別為84%和92%、84%和88%、92%和86%、92%和94%，見圖1、表4。

3 討 論

AIS是一種多生物因子、多信號通路參與的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有發(fā)病急和預(yù)后差的特點，給我國公民帶來沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13-15]。雖然已有相關(guān)研究證實,超敏C反應(yīng)蛋白及膠原纖維酸性蛋白可作為AIS的生物標(biāo)志物，但目前臨床中仍未應(yīng)用AIS的特異性血清標(biāo)志物[16-19]。同時，隨著miRNA參與AIS機(jī)制研究的逐漸深入，可通過檢測患者外周血液中miRNA表達(dá)的變化來監(jiān)測AIS的發(fā)展過程，因此,miRNA極有可能成為AIS新的診斷標(biāo)志物[20-21]。

近年來，已有研究證實，miRNA-17-5p在自發(fā)性高血壓性卒中大鼠的血清中顯著上升，而miRNA-17-5p也廣泛參與腦血管慢性后遺癥的病理過程，這些研究結(jié)果表明miRNA-17-5p與腦血管疾病密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍然不明[22]。本研究發(fā)現(xiàn)AIS患者血清中miRNA-17-5p的水平顯著上升，且與腦卒中患者NIHSS評分呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實miRNA-17-5p可增加AIS患病風(fēng)險，這與前期基礎(chǔ)研究結(jié)果也相一致。

miRNA-103-3p可能通過正向調(diào)節(jié)靶基因srebf1的表達(dá)進(jìn)而參與肝臟脂質(zhì)代謝途徑，最終可影響代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展[23]。而國內(nèi)研究也表明，miRNA-103-3p可導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[24]。本研究結(jié)果顯示，AIS患者的血清miRNA-103-3p表達(dá)水平顯著高于對照，筆者認(rèn)為這可能是由于腦脊液中的miRNA進(jìn)入患者外周血從而引起血清水平升高。本研究結(jié)果表明，miRNA-144-3p水平在病例組顯著增加，并且與NHISS評分呈正相關(guān)，這一結(jié)果表明miRNA-144-3p可能顯著增加AIS的患病風(fēng)險，同時筆者認(rèn)為這可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡從而加劇AIS的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線下面積結(jié)果顯示，血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p對AIS患者具有一定的診斷價值，當(dāng)聯(lián)合miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p指標(biāo)時診斷AIS患者的靈敏度達(dá)92%，特異度達(dá)94%，這一結(jié)果提示聯(lián)合miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p三者檢測對AIS的診斷具有更小的誤診率和漏診率，也為臨床應(yīng)用提供了可靠的理論基礎(chǔ)。

4 討 論

綜上所述，miRNA-17-5p、miRNA-103-3p與miRNA144-3p表達(dá)水平與AIS的患病風(fēng)險有一定的關(guān)系，而三者聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高AIS患者的診斷率，但是否與AIS的預(yù)后有關(guān)仍需作進(jìn)一步深入研究。