李國風(fēng) 張勤增 解麗君 姜紅 李立萍 郝娜 張建新

中風(fēng)是導(dǎo)致殘疾的重要原因之一，其損傷的相關(guān)危險因素主要包括：興奮性損害、Ca2+超載、自由基及脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子失衡等。目前，溶栓仍為臨床治療腦缺血的主要手段，但一部分患者在溶栓治療后由于再灌注等原因?qū)е虏∏榧又?。因此，有關(guān)腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防措施及治療手段成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是機(jī)體內(nèi)一種重要的氣體信號分子，研究表明，H2S在多種病理生理過程尤其是腦缺血過程中發(fā)揮著重要作用[1]。凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因調(diào)控的主動而有序的細(xì)胞死亡過程。凋亡是參與缺血性腦損傷過程中細(xì)胞死亡的一種重要形式[2]。最近研究表明，H2S與凋亡密切相關(guān)，但其在凋亡過程中的確切機(jī)制尚不明確[3,4]，尤其是在腦缺血后引起的細(xì)胞凋亡過程中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)、Western blot、TUNEL等方法，觀察H2S對局灶性腦缺血損傷后神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，從凋亡途徑探討在H2S對大鼠局灶性腦缺血損傷作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重(265±15)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：201108043。

1.1.2 試劑：兔抗Caspae-3單抗武漢博士德公司；鼠抗bcl-2單抗美國Santa Cruz；鼠抗bax單抗美國Santa Cruz；分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中國上海生物工程公司；SP免疫組化檢測試劑盒北京中山公司；N,N,N,N,-四甲基乙二胺(TEMED)，美國Sigma；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器：電泳儀DYY-Ⅲ7B型水浴電轉(zhuǎn)膜儀DYY-Ⅲ40B北京市六一儀器廠；低溫高速臺式離心機(jī)Hitachi 20PI-52型日立公司；電子分析天平梅特勒-AE240瑞士梅特勒公司；超低溫冰箱(-80℃) 日本SANYO公司；

1.2 大鼠局灶性腦缺血模型制備 將40只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、缺血模型組、H2S低劑量組、H2S中劑量組、H2S高劑量組，每組8只。大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，用電熱燒灼器將頸外動脈的分支燒斷，結(jié)扎并游離頸外動脈主干一段，在頸外動脈游離段上剪開一小口，將預(yù)先制備好的尼龍線栓子插入，尼龍線插入深度平均為(18.5±0.5)mm。以插入尼龍線栓子作為缺血記時的開始，動物蘇醒后，出現(xiàn)霍納(Horner)綜合征：左側(cè)眼裂變小并右側(cè)偏癱，以右上肢更為明顯；提尾懸拉后出現(xiàn)右上肢蜷縮屈曲；下地不能直行，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈跌倒，挑選手術(shù)成功、符合上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組頸部切開，只分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈但不剪開血管和插入插線栓。H2S低、中、高劑量組分別于大鼠腦缺血3 h時腹腔注射0.7、1.4、2.8 mg/kg的H2S，假手術(shù)組和缺血模型組注射等容量的0.9%氯化鈉溶液。5組大鼠均于缺血24 h腹主動脈取血并斷頭取腦。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

1.3.1 HE染色觀察組織學(xué)變化：5組大鼠均于缺血24 h斷頭取腦，以視交叉附近冠狀切片，切片厚度約為4 mm，以10%甲醛溶液固定切片，70%～100%的乙醇濃度梯度脫水，然后于二甲苯中透明2次，再入石蠟中進(jìn)行包埋，仔細(xì)修好蠟塊后固定于石蠟切片機(jī)上進(jìn)行切片，片厚為4 μm，將蠟片完全展開并貼附在清潔干燥的載玻片上，4℃冰箱保存，進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡觀察染色結(jié)果。

1.3.2 TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：切片常規(guī)脫蠟至水，用蛋白酶K(20 μg/ml溶于Tris/HCL中，pH值7.4～8.0)室溫孵育15～30 min。PBS沖洗2次，滴加50 μl的TUNEL反應(yīng)混合溶液，濕盒中孵育60 min，PBS沖洗3次，加入50 μl轉(zhuǎn)化劑，在濕盒中37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，加入100 μl DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次。封片，在光鏡下分析結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)有棕黃色粗顆粒分布或棕黃色細(xì)膩顆粒彌漫者為陽性細(xì)胞。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法(生物素-抗生物素-過氧化物酶復(fù)合物ABC法，簡稱ABC法)檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)：10%甲醛溶液固定腦組織標(biāo)本，石蠟切片并脫蠟至水，緩沖液清洗3次，5 min/次，3%的H2O2-甲醇常溫孵育20 min，緩沖液清洗3次，5 min/次；水浴鍋中95℃加熱修復(fù)抗原20 min后血清封閉，室溫孵育30 min；加入稀釋一抗后4℃過夜；次日緩沖液清洗3次后加入與一抗特異結(jié)合的生物素標(biāo)記二抗，37℃濕盒孵育30 min，再加入與二抗結(jié)合的三抗，37℃濕盒孵育30 min；緩沖液清洗3次，DAB顯色20 min，顯微鏡下觀察并控制顯色程度；蒸餾水充分沖洗數(shù)遍終止進(jìn)行的顏色反應(yīng)；蘇木素行復(fù)染并乙醇梯度脫水，二甲苯透明，采用樹脂封片，普通光學(xué)顯微鏡觀察陽性細(xì)胞表達(dá)部位并記數(shù)：在400倍光鏡視野下對切片隨機(jī)取8個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 Western Blot檢測Caspase-3蛋白的表達(dá)：取大鼠腦組織約60 mg加入1 ml細(xì)胞裂解液充分研磨，12 000 g/min離心10 min，將上清液蛋白提取液和點(diǎn)樣緩沖液1∶1體積混勻，置沸水中變性約8 min，12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃約4 h(濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V)，將PVDF膜和濾紙置轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡約20 min，切去凝膠的左上角作為正反面的標(biāo)記，緩沖液中約10 min平衡凝膠，轉(zhuǎn)移盤由下至上按順序放置海綿、濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)移膜、濾紙、海綿，趕盡氣泡，鎖緊轉(zhuǎn)移盤，膠側(cè)是負(fù)極，膜側(cè)是正極，溫度4℃，電壓100 V，轉(zhuǎn)移2 h，麗春紅染色檢查蛋白轉(zhuǎn)移程度，漂洗膜(T-TBS緩沖液)5%的脫脂奶粉室溫震蕩封閉約2 h，加入稀釋一抗，充分顛倒混勻后4℃封閉過夜后加入二抗，37℃震蕩1 h，暗室爆光，相機(jī)拍照，AlphEase FC軟件分析結(jié)果，目的蛋白條帶灰度值與其目的蛋白GAPDH灰度值比值對比進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察H2S對局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化的影響 光鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞核仁清晰、核圓形，核膜完整；而缺血模型組大鼠缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞壞死，細(xì)胞腫脹，胞核濃縮，胞漿疏松淡染及空泡化；H2S 中、高劑量組上述病理變化明顯改善。見圖1。

假手術(shù)組缺血模型組H2S高劑量組H2S中劑量組H2S低劑量組

圖1 5組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變圖(光學(xué)顯微鏡×400)

2.2 TUNEL 法檢測H2S對局灶性腦缺血損傷大鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL檢測結(jié)果顯示，缺血組大鼠神經(jīng)細(xì)胞核呈棕黃色，著色細(xì)胞數(shù)多且著色深，凋亡率明顯高于假手術(shù)組 (P<0.01)，H2S中、高劑量組腦神經(jīng)元的凋亡百分率明顯降低，并且著色細(xì)胞數(shù)減少，著色變淺(P<0.01)。見圖2，表1。

假手術(shù)組缺血模型組H2S高劑量組H2S中劑量組H2S低劑量組

圖2 5組大鼠神經(jīng)元Tunnel檢測結(jié)果圖

2.3 H2S對局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 免疫組化檢測結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性細(xì)胞在光鏡下染色呈現(xiàn)棕黃色，主要在神經(jīng)元胞漿和血管內(nèi)皮表達(dá)。假手術(shù)組可見少量的Bcl-2和Bax蛋白陽性細(xì)胞，缺血模型組可見少量Bcl-2和大量Bax陽性細(xì)胞；與缺血模型組比較，H2S 中、高劑量組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，Bax 陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。見圖3、4，表1。

假手術(shù)組缺血模型組H2S高劑量組H2S中劑量組H2S低劑量組

圖3 5組大鼠腦組織Bcl-2表達(dá)免疫組化圖(SP×400)

2.4 H2S對局灶性腦缺血損傷大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，與假手

假手術(shù)組缺血模型組H2S高劑量組H2S中劑量組H2S低劑量組

圖4 5組大鼠腦組織Bax表達(dá)免疫組化圖(SP×400)

術(shù)組比較，缺血模型組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與缺血模型組比較，H2S 中、高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)。見圖5，表1。

假手術(shù)組缺血模型組H2S高劑量組H2S中劑量組H2S低劑量組

圖5 5組大鼠腦組織caspase-3表達(dá) western blot 圖

組別劑量(mg/kg)凋亡率(%)Bcl-2(%)Bax(%)Caspase-3(相對密度)空白對照組-9.68±2.2316.39±4.107.22±1.071.26±0.17缺血模型組-20.71±2.88*11.81±3.04*31.45±3.77*4.43±0.42*H2S高劑量組2.811.28±3.21#27.25±3.04#22.01±2.89#3.77±0.47#H2S中劑量組1.413.19±1.97#23.72±2.73#25.82±3.67#3.51±0.64#H2S低劑量組0.719.98±2.5512.72±2.2430.82±4.624.35±0.89

注：與空白對照組比較,*P<0.01;與缺血模型組比較,#P<0.01

3 討論

腦缺血是非常嚴(yán)重的臨床疾病之一，尤其是缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元壞死，具有極高的致死率，即使是幸存患者，其生活質(zhì)量也嚴(yán)重下降，同時引起諸多家庭和社會問題。腦缺血后的氧化應(yīng)激反應(yīng)引起神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元壞死；缺血可激活凋亡蛋白，啟動凋亡程序進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元凋亡；缺血同時可激活大量炎性細(xì)胞因子，引起局部嚴(yán)重的炎性反應(yīng)；總之關(guān)于腦缺血的機(jī)制和治療成為當(dāng)今社會的研究熱點(diǎn)之一。

H2S已經(jīng)被確定為繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號分子，具有氣體信號分子的一系列特征[5]。目前的研究表明，內(nèi)源性H2S的生成途徑有三條，胱硫醚β合酶途徑、胱硫醚γ裂解酶途徑、3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶途徑[6]。H 2S在體內(nèi)可水解為Na+和 HS-，HS-可與體內(nèi)的H+再結(jié)合后生成H2S，H2S和NaHS之間以水解和結(jié)合的形式形成一種動態(tài)平衡 。H2S可自由通過細(xì)胞膜，存在于機(jī)體的多個組織器官，生理狀態(tài)下即發(fā)揮著重要作用：舒張血管和消化道平滑肌、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、參與神經(jīng)元興奮、調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶功能等。

許多研究已經(jīng)表明H2S是一種新型的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子和信號傳遞份子，參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程，如阿爾莫茨病、同型半胱氨酸尿癥、低下綜合征、反復(fù)熱性驚厥、缺血再灌注損傷等[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明， H2S可通過降低腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)改善缺血性腦損傷，通過線粒體途徑的細(xì)胞凋亡途徑參與腦缺血的病理生理過程，并且不同劑量的外源性H2S對腦缺血可產(chǎn)生雙重作用[8,9]。硫化氫還能抑制局灶性腦缺血后NF-κB的活化，阻斷NF-κB相關(guān)信號通路的傳導(dǎo)，下調(diào)TNF-α、IL-1β的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，從而減輕腦缺血損傷[10,11]。本研究結(jié)果表明，外源性給予H2S的供體NaHS，局灶性腦缺血大鼠的缺血神經(jīng)組織損傷明顯減輕，同時神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯減低、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，表明外源性給予H2S，在改善腦組織氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)的同時，還可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而改善腦缺血損傷。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的程序化細(xì)胞主動自毀過程，研究表明，其過程主要涉及兩種信號通路：一條是通過Fas/FasL及TNF/TNFR依次激活Caspase-8和Caspase-3的死亡受體通路；一條是線粒體途徑的信號通路，即線粒體在各種凋亡刺激信號的細(xì)胞整合過程中起核心作用。線粒體外膜富含多不飽和脂肪酸，凋亡刺激信號經(jīng)逐級放大后進(jìn)而攻擊線粒體外膜導(dǎo)致線粒體腫脹，線粒體膜流動性的降低導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔迅速開放，進(jìn)而激發(fā)細(xì)胞色素C及相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，啟動Caspase蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)： Caspase-9首先活化，而后下游Caspase-3進(jìn)一步活化，最后細(xì)胞凋亡發(fā)生[11,12]。不管以上哪種途徑，激活凋亡的最后通路都是活化Caspase-3。Caspase-3 是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，正常狀態(tài)下在細(xì)胞內(nèi)以無活性的前體形式存在，腦缺血后活化并參與調(diào)控神經(jīng)元的凋亡過程，是凋亡途徑下游進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶，是凋亡的效應(yīng)分子和執(zhí)行者。它的活化可激活核酸內(nèi)切酶、降解DNA修復(fù)酶和細(xì)胞骨架蛋白進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。腦缺血損傷后，缺血的核心區(qū)和半暗帶區(qū)神經(jīng)元死亡的機(jī)制并不相同，一般認(rèn)為壞死主要發(fā)生在缺血的核心區(qū)，而凋亡主要發(fā)生在缺血核心區(qū)的周邊區(qū)域，即半暗帶區(qū)域[14，15]。由于發(fā)生凋亡的細(xì)胞不會立即死亡，因此為藥物干預(yù)治療提供了可能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血后出現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞損傷，腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯上升，細(xì)胞凋亡率顯著升高， 而給予H2S后大鼠Caspase-3蛋白表達(dá)減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，表明Caspase-3參與了局灶性腦缺血損傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，外源性給予H2S可能通過抑制Caspase-3激活或釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。

Bcl-2和Bax為同源二聚體，是Bcl-2家族中非常重要的基因，兩者作用相互拮抗，Bcl-2起到抑制細(xì)胞凋亡作用，而Bax則起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[16-18]。Bcl-2大量生時保護(hù)細(xì)胞免受攻擊，當(dāng)Bax過量生成時則形成Bax同源二聚體從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過與Bax組成異源二聚體，從而阻止Bax誘導(dǎo)的凋亡作用。因此，Bcl-2與Bax蛋白的比例在一定程度上決定了細(xì)胞是凋亡還是存活[19，20]。本研究結(jié)果顯示，缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)， Bcl-2蛋白表達(dá)減弱； 給予H2S后，Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)減弱，表明H2S可通過調(diào)整Bcl-2/Bax平衡而發(fā)揮減輕缺血性腦損傷作用。本研究結(jié)果為H2S應(yīng)用于臨床治療腦缺血損傷提供了理論基礎(chǔ)。