黃強 韓強

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥、也是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要病因。近年來，我國糖尿病的發(fā)生率逐年升高且糖尿病患者的血糖控制達(dá)標(biāo)率較低，這也直接導(dǎo)致了DN發(fā)患者數(shù)的增加[1,2]。DN的發(fā)病機制復(fù)雜，其中高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞增生、內(nèi)皮細(xì)胞損害、細(xì)胞外基質(zhì)增厚及重塑是公認(rèn)的與DN發(fā)生直接相關(guān)的病理環(huán)節(jié)，針對以上病理環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)也是DN治療的潛在靶點。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)是由空腸和回腸L細(xì)胞分泌的小分子多肽，能夠以葡萄糖依賴性的方式刺激胰島素分泌并起到降糖作用。新近的多項細(xì)胞實驗研究證實，GLP-1對高糖、過氧化氫、缺氧等病理因素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[3-5]，也有動物實驗證實GLP-1對糖尿病大鼠的腎功能具有改善作用，但GLP-1是否能夠減輕高糖環(huán)境下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷尚未明確。為此，本研究選擇人源腎小球微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)作為實驗對象，具體分析了GLP-1對高糖條件下HRGEC損傷的調(diào)節(jié)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑:HRGEC細(xì)胞購自ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶均購自Gibco公司，GLP-1購自Sigma公司，TUNEL染色試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自上海碧云天公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)檢測試劑盒購自南京建成研究所，培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑、Talent熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司。

1.1.2 實驗儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速離心機購自Thermo公司，熒光顯微鏡購自Nikon公司，熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)方法：HRGEC細(xì)胞用含有10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。傳代后得到足夠數(shù)量的對數(shù)生長期HRGEC細(xì)胞，進(jìn)行分組處理，具體如下：①對照組用含有5.5 mol/L葡萄糖的DMEM處理；②高糖組：用含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM處理；③GLP-1組：用含有30 mmol/L葡萄糖及30 nmol/L GLP-1的DMEM處理。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率的檢測方法：不同條件處理后24 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞過夜后采用TUNEL試劑盒中的TUNEL染色液和DAPI染色液對細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)目及DAPI陽性染色細(xì)胞數(shù)目后計算凋亡率。

1.2.3 細(xì)胞中基因mRNA表達(dá)的檢測方法：不同條件處理后24 h，收集細(xì)胞后采用北京天根公司的試劑盒分離細(xì)胞中的總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA 1 μl、5 μmol/L的上游引物溶液及下游引物溶液各0.5 μl、Talent熒光定量檢測試劑盒中的反應(yīng)液10 μl及去離子水8 μl，混勻后在PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)熒光曲線并以β-actin為內(nèi)參計算FasL、Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3、SIRT1、eNOS、NOX4的mRNA表達(dá)水平。

1.2.4 培養(yǎng)基中氧化應(yīng)激指標(biāo)及NO的檢測方法:不同條件處理后24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基后采用南京建成研究所的試劑盒測定MDA、SOD、GSH的含量，采用上海碧云天的試劑盒測定NO含量。

2 結(jié)果

2.1 3組間細(xì)胞凋亡率的比較 對照組、高糖組和GLP-1組的細(xì)胞凋亡率分別為(6.23±0.94)%、(26.62±5.28)%、(11.75±2.03)%。高糖組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，GLP-1組的細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組間細(xì)胞凋亡率的比較；與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05

2.2 3組間凋亡基因表達(dá)比較 高糖組細(xì)胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組(P<0.05)；GLP-1組細(xì)胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯低于高糖組(P<0.05)，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯高于高糖組(P<0.05)。見表1。

組別FasL/β-actinFas/β-actinBax/β-actinBcl-2/β-actinCaspase-3/β-actin對照組 1.02±0.161.04±0.180.97±0.131.01±0.150.99±0.12高糖組 1.89±0.28*2.05±0.37*2.18±0.41*0.51±0.09*1.78±0.26*GLP-1組1.44±0.22#1.55±0.21#1.61±0.29#0.78±0.12#1.38±0.19#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

2.3 3組間氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 高糖組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯高于對照組(P<0.05)，SOD、GSH的含量明顯低于對照組(P<0.05)；GLP-1組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯低于高糖組(P<0.05)，SOD、GSH的含量明顯高于高糖組；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

組別MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(U/ml)對照組 2.41±0.3631.26±5.5825.63±4.24高糖組 11.77±1.84*14.51±2.37*12.67±2.17*GLP-1組4.95±0.77#20.93±3.85#19.48±3.27#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

2.4 3組間SIRT1信號通路比較 高糖組細(xì)胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯低于對照組(P<0.05)，細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(P<0.05)；GLP-1組細(xì)胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯高于高糖組(P<0.05)，細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平明顯低于高糖組(P<0.05)。見表3。

組別SIRT1/β-actineNOS/β-actinNO(μmol/L)NOX4/β-actin對照組 1.03±0.171.01±0.158.48±1.211.05±0.17高糖組 0.44±0.09*0.53±0.09*3.44±0.61*2.19±0.36*GLP-1組0.76±0.12#0.82±0.12#6.86±0.94#1.44±0.20#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

3 討論

腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生損傷是DN發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)，針對高糖誘導(dǎo)的腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行干預(yù)是治療DN的有效靶點[6,7]。GLP-1是一類新型的降糖藥物，通過葡萄糖依賴性的方式刺激胰島素分泌來起到降糖作用；新近也有研究表明，GLP-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，能夠減輕高糖、過氧化氫、缺氧等病理因素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。但是，GLP-1對高糖引起的腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞損害是否具有保護(hù)作用并未闡明。本研究以HRGEC細(xì)胞作為實驗對象，用高糖培養(yǎng)基處理后觀察到：高糖組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，提示HRGEC細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生了過度凋亡；在高糖誘導(dǎo)HRGEC細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用GLP-1進(jìn)行干預(yù)后觀察到：GLP-1組的細(xì)胞凋亡率明顯低于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導(dǎo)的HRGEC細(xì)胞凋亡具有顯著抑制作用，進(jìn)而也表明GLP-1對HRGEC具有保護(hù)作用。

死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑是內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的兩種不同機制，前者受到Fas/FasL的調(diào)控、后者受到Bcl-2/Bax的調(diào)控。FasL與Fas結(jié)合后通過細(xì)胞內(nèi)的FADD結(jié)構(gòu)域來招募Caspase-8，促進(jìn)Caspase-8及下游信號發(fā)生級聯(lián)激活，最終引起Caspase-3活化[8,9]；Bcl-2和Bax通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放來影響Caspase-9的激活，前者阻礙Caspase-9激活、后者促進(jìn)Caspase-9激活，進(jìn)而改變下游信號的級聯(lián)激活及Caspase-3的活化。兩種不同機制均最終引起Caspase-3的活化并啟動細(xì)胞凋亡[10,11]。本研究對HRGEC細(xì)胞中以上凋亡基因表達(dá)的分析顯示：高糖組細(xì)胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組，提示高糖能夠使HRGEC細(xì)胞的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑均發(fā)生過度活化。在使用GLP-1干預(yù)后觀察到：GLP-1組細(xì)胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯低于高糖組，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯高于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑激活具有抑制作用。

高糖環(huán)境除了能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷外，還能通過增加氧自由基的生成來引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。氧自由基具有極強的氧化性，能夠與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的多種成分發(fā)生氧化反應(yīng)并造成膜結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞膜的破壞會造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害、線粒體膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的破壞會造成細(xì)胞功能損害[12]。細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜中含有豐富脂質(zhì)，與氧自由基發(fā)生氧化反應(yīng)后生成MDA；細(xì)胞本身含有SOD、GSH等抗氧化物，在催化氧自由基發(fā)生發(fā)生還原反應(yīng)的過程中大量消耗[13,14]。本研究對HRGEC細(xì)胞培養(yǎng)基中上述氧化應(yīng)激產(chǎn)物的分析顯示：高糖組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯高于對照組，SOD、GSH的含量明顯低于對照組，提示高糖能夠引起HRGEC細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)的過度激活。在使用GLP-1干預(yù)后觀察到：GLP-1組細(xì)胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯低于高糖組，SOD、GSH的含量明顯高于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有抑制作用。

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的調(diào)控與細(xì)胞內(nèi)多條信號通路有關(guān)，其中SIRT1通路既能通過調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)及NO的生成來發(fā)揮抗凋亡作用，也能通過抑制NOX4的表達(dá)來起到抗氧化應(yīng)激作用。eNOS是特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的NOS分子，在催化精氨酸代謝的過程中產(chǎn)生NO并通過NO 的活性來保護(hù)內(nèi)皮、抑制凋亡[15,16]；NOX4是內(nèi)皮細(xì)胞中催化活性氧產(chǎn)生的NOX家族分子，SIRT1通過抑制NOX4的表達(dá)、減少活性氧的產(chǎn)生來抑制內(nèi)皮的氧化應(yīng)激損傷[17,18]。本研究對HRGEC細(xì)胞培養(yǎng)基中上述SIRT1通路的分析顯示：高糖組細(xì)胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯低于對照組，細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組；而GLP-1干預(yù)后GLP-1組細(xì)胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達(dá)水平及細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯高于高糖組，細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平明顯低于高糖組。這一結(jié)果表明GLP-1能促進(jìn)高糖條件下HRGEC細(xì)胞中SIRT1通路的激活，這也可能是GLP-1發(fā)揮抗凋亡及抗氧化應(yīng)激的分子機制。

綜上所述，GLP-1能夠減輕高糖條件下HRGEC的凋亡及氧化應(yīng)激，同時也能促進(jìn)SIRT1信號通路的激活；激活SIRT1信號通路可能是GLP-1發(fā)揮抗凋亡及抗氧化應(yīng)激的分子機制。