李佳蔚，王 嬌，徐家怡，程吉祥，劉 青，伍 慶?

（1.貴州師范大學(xué)，貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2.貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司，貴州 貴陽 550018）

筋骨傷噴霧劑是以貴州苗藥赤脛散為主，配以地龍、赤芍、淫羊藿、制草烏、薄荷腦，55%乙醇浸制而成，具有消腫止痛、活血化瘀的作用，用于摔傷、扭傷等軟組織損傷，方中君藥赤脛散為蓼科植物赤脛散Polygonum runcinatumBuch.-Ham.ex D.Don var.sinenseHemsl.的干燥根莖，分布于四川、貴州、云南等地，其性寒，味苦、澀，無毒，具有活血舒筋、清熱解毒之功效，主治勞傷腰痛、跌打損傷等［1-4］，主要含有酚酸、揮發(fā)油［5-7］，其中鞣花酸是一種有效的凝血?jiǎng)?］，對(duì)多種細(xì)菌、病毒都有很好的抑制作用［9］，能保護(hù)創(chuàng)面免受細(xì)菌侵入，防止感染，抑制潰瘍［10］；赤芍主要成分芍藥苷具有廣泛的抗炎作用［11-14］，并且表現(xiàn)出明顯鎮(zhèn)痛活性［15］；淫羊藿主要包括黃酮、生物堿、多糖等多種活性成分，其中淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 是黃酮類代表成分，具有促進(jìn)骨骼發(fā)育的作用，可提高骨密度，增加骨強(qiáng)度［16］，上述7 種成分藥效均與筋骨傷噴霧劑功能主治一致。

然而，現(xiàn)行筋骨傷噴霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)君藥赤脛散僅有TLC 定性鑒別［17］，而定量指標(biāo)僅為赤芍中芍藥苷［3］，過于簡單，難以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。為了進(jìn)一步發(fā)揮中藥多組分的協(xié)同作用，保證產(chǎn)品質(zhì)量均一、穩(wěn)定、可控［18-20］。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測定筋骨傷噴霧劑中芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的含有量，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（配置在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD 檢測器）、Agilent 色譜工作站（美國Agilent 公司）；CH-250超聲波清洗機(jī)（北京創(chuàng)新德超聲電子研究所）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（邦西儀器科技有限公司）；XS-105 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；移液槍（20～200、100～1 000 μL，德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑與藥物 芍藥苷（批號(hào)wkq18032104）、鞣花酸（批號(hào)wkq18020502）、朝藿定A（批號(hào)wkq17040509）、朝藿定B（批號(hào)wkq17032809）、朝藿定C（批號(hào)wkq17040701）、寶藿苷Ⅰ（批號(hào)wkq16081303）對(duì)照品均購于四川維克奇生物科技有限公司；淫羊藿苷（批號(hào)110737-200414）對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院。筋骨傷噴霧劑（100 mL/瓶，貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20181003）。乙腈、甲醇為色譜純；甲醇、正丁醇、磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（B）-甲醇（C），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；檢測波長0～23 min 時(shí)230 nm，23～54 min 時(shí)254 nm，54～137 min 時(shí)270 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ對(duì)照品適量，甲醇溶解制得質(zhì)量濃度分別為4.000、2.400、1.500、1.200、0.900、1.180、0.900 mg/mL，精密量取適量，甲醇稀釋，即得（質(zhì)量濃度分別為0.529、0.322、0.034、0.022、0.050、0.056、0.029 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取本品5 mL，置于蒸發(fā)皿中蒸干，精密加入5 mL 水溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，10 mL 水飽和正丁醇溶液萃取2次，取上層澄清液置于蒸發(fā)皿中蒸干，甲醇溶解后定容至10 mL 量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照本品處方及生產(chǎn)工藝，分別制備缺赤脛散、赤芍、淫羊藿的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下鞣花酸對(duì)照品溶液0.134、0.335、0.671、1.010、1.340、1.675 mL，置于5 個(gè)5 mL 量瓶中，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液0.132、0.331、0.661、0.992、1.322、1.653 mL，朝藿定A 對(duì)照品溶液275、220、165、110、55、22 μL，朝藿定B 對(duì)照品溶液225、180、135、90、45、18 μL，朝藿定C對(duì)照品溶液700、560、420、280、140、56 μL，淫羊藿苷對(duì)照品溶液600、480、360、240、120、48 μL，寶藿苷Ⅰ對(duì)照品溶液400、320、240、160、80、32 μL，甲醇定容，搖勻，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積RSD 分別為2.1%、2.9%、0.8%、1.6%、0.7%、0.6%、0.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)20181003），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ含有量RSD 分別為1.4%、2.3%、2.8%、2.4%、2.4%、2.3%、2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ峰面積RSD 分別為2.2%、2.7%、2.5%、1.8%、2.2%、1.6%、0.9%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取含有量已知的本品（批號(hào)20181003）9 份，每份2.5 mL，置于100 mL 蒸發(fā)皿中，精密加入適量芍藥苷（0.500 mg/mL）、鞣花酸（0.448 mg/mL）、朝藿定A（0.024 mg/mL）、朝藿定B（0.037 mg/mL）、朝藿定 C（0.023 mg/mL ）、淫羊藿 苷（0.152 mg/mL）、寶藿苷Ⅰ（0.011 mg/mL）對(duì)照品溶液，使高、中、低質(zhì)量濃度對(duì)照品加入量與供試品中待測定成分量之比分別在0.5∶1、1∶1、1.5∶1 左右，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每種質(zhì)量濃度3 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。測得芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ平均加樣回收率分別為95.6%、96.0%、97.8%、94.5%、93.5%、96.7%、99.6%，RSD 分別為1.4%、1.8%、2.3%、1.5%、2.7%、2.4%、1.9%。

2.4 樣品含有量測定 取3 批本品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批3 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（mg/mL，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg/mL，n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了水飽和正丁醇、乙酸乙酯對(duì)各成分提取率的影響，發(fā)現(xiàn)后者萃取后不能檢測出朝藿定A，故選擇前者作為萃取劑。然后，又對(duì)萃取時(shí)pH 值（酸性、中性、堿性）、萃取次數(shù)（1、2、3 次）進(jìn)行了考察，最終確定供試品溶液制備方法為中性純凈水加入10 mL 水飽和正丁醇萃取2 次。

3.2 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相甲醇-水、乙腈-甲醇-水、乙腈-甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀，確定乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀-甲醇，此時(shí)各色譜峰分離效果最佳。再考察了檢測波長，發(fā)現(xiàn)芍藥苷、鞣花酸、淫羊藿苷最大吸收波長分別為230、254、270 nm，并且0～23 min 時(shí)230 nm、23～54 min 時(shí)254 nm、54～137 min 時(shí)270 nm 下各成分響應(yīng)值較高，峰形良好，分離度理想。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測定筋骨傷噴霧劑中芍藥苷、鞣花酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ的含有量，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。