徐暢 丁煒東 曹哲明 邴旭文 張晨光 谷心池 劉雨

摘要：【目的】從酶活性和基因表達(dá)水平分析低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）應(yīng)激的生理響應(yīng)過程，為其健康養(yǎng)殖及耐低氧品種選育提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā窟x取體表無損傷、體重450±20 g/尾、體長(zhǎng)24.0±0.7 cm的健康翹嘴鱖進(jìn)行低氧（溶解氧含量2.8±0.2 mg/L）脅迫，設(shè)常氧（溶解氧含量6.5±0.2 mg/L）為對(duì)照組，分別在低氧脅迫0、6、12、24、48和96 h時(shí)采集翹嘴鱖的肝臟和鰓組織樣品，進(jìn)行抗氧化酶、呼吸相關(guān)酶活性及低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定?！窘Y(jié)果】在整個(gè)急性低氧脅迫過程中，翹嘴鱖肝臟過氧化氫酶（CAT）活性、還原型谷胱甘肽（GSH）含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，GSH含量從低氧脅迫6 h起顯著高于對(duì)照組（P<0.05，下同），CAT和GPT活性從低氧脅迫12 h起顯著高于對(duì)照組。鰓組織乳酸脫氫酶（LDH）活性先升高后降低再升高，在脅迫6 h時(shí)達(dá)最高值（849.67 U/mg），顯著高于對(duì)照組;超微量總ATP酶（ATPase）活性呈降低—升高—降低的變化趨勢(shì)，且顯著低于對(duì)照組。低氧脅迫組翹嘴鱖肝臟HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫48 h后顯著上調(diào);EPO基因的相對(duì)表達(dá)量先升高后降低，在脅迫12 h時(shí)顯著上調(diào);HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫6和48 h分別出現(xiàn)峰值，其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組持平。【結(jié)論】急性低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖肝臟抗氧化酶、鰓組織呼吸相關(guān)酶及低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)均產(chǎn)生顯著影響。雖然翹嘴鱖能通過自我調(diào)節(jié)抗氧化酶和呼吸相關(guān)酶活性及上調(diào)低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，促使機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境，但溶解氧降至2.8 mg/L以下即對(duì)其產(chǎn)生不利影響，因此在實(shí)際養(yǎng)殖過程中須密切關(guān)注養(yǎng)殖水體溶解氧變化。

關(guān)鍵詞： 翹嘴鱖;低氧脅迫;抗氧化酶;呼吸相關(guān)酶;低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因

0 引言

【研究意義】溶解氧（Dissolved oxygen，DO）是影響魚類生存和生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，影響水體溶解氧的因素很多，包括天氣、水流和水溫等（Wu et al.，2020）。大多數(shù)魚類具有適應(yīng)溶解氧波動(dòng)的能力，但溶解氧長(zhǎng)期處于較低水平，則會(huì)對(duì)魚類造成不可逆損傷，甚至導(dǎo)致死亡（Abdel-Tawwab et al.，2019），給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失。因此，探究低氧脅迫下魚類生理生化指標(biāo)及相關(guān)基因的表達(dá)變化規(guī)律，明確魚類對(duì)低氧的效應(yīng)及耐受限度，對(duì)科學(xué)指導(dǎo)魚類高密度養(yǎng)殖具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】隨著養(yǎng)殖水體中溶解氧水平的降低，魚類的呼吸和攝食活動(dòng)會(huì)隨之降低，其生理和代謝活動(dòng)也受到不利影響（Wedemeyer，1996）。魚類響應(yīng)低氧脅迫是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，是多種因素相互作用的結(jié)果（熊向英等，2016），通常需要在基因水平、信號(hào)通路及低氧信號(hào)途徑網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等不同層面進(jìn)行深入探討。Pichavant等（2002）研究表明，在嚴(yán)重低氧條件下魚類的有氧呼吸速率受到影響，腺苷三磷酸（ATP）產(chǎn)生減慢，導(dǎo)致肌肉組織中乳酸含量發(fā)生變化;Rinaldi等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，在輕度低氧條件下歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）的鰓組織結(jié)構(gòu)會(huì)受到影響;Omlin和Weber（2010）在研究虹鱒（Oncorhynchus mykiss）時(shí)發(fā)現(xiàn)，由低氧引起的乳酸增加在降低循環(huán)中乳酸負(fù)荷具有戰(zhàn)略性作用;狄治朝等（2018）研究表明，斑馬魚（Danio rerio）在低氧脅迫下Hsp90ab1基因相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì);Sun等（2020）研究表明，大嘴鱸（Micropterus salmoides）受低氧脅迫時(shí)其肝臟的過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性明顯升高;張凱強(qiáng)等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α基因在花鱸的低氧應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。此外，在團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）（王慧娟，2015）、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）（陳世喜等，2016）、河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）（賈秀琪等，2017）、花鱸（常志成等，2018）、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）（孫俊霄等，2019）的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)低氧脅迫能誘導(dǎo)抗氧化酶呈規(guī)律性變化。【本研究切入點(diǎn)】翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）是人工養(yǎng)殖鱖魚的主要品種，但其耐低氧能力較弱，尤其隨著養(yǎng)殖規(guī)?；图s化的發(fā)展，養(yǎng)殖水體中的溶解氧水平已成為翹嘴鱖養(yǎng)殖不可忽視的重要環(huán)境因素之一。至今，有關(guān)鱖魚耐氧能力的研究主要集中在窒息點(diǎn)和耗氧率探析（楊春等，2003）及利用池塘微孔增氧進(jìn)行生態(tài)高效養(yǎng)殖（蔡建中等，2011;劉林，2011;章愛華，2017）等方面，而針對(duì)翹嘴鱖的耐低氧機(jī)制研究尚無報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究急性低氧脅迫下翹嘴鱖抗氧化酶、呼吸相關(guān)酶活性及低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的變化規(guī)律，從酶活性和基因表達(dá)水平分析低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖應(yīng)激的生理響應(yīng)過程，為其健康養(yǎng)殖及耐低氧品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)用魚

供試翹嘴鱖取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院南泉養(yǎng)殖基地，選取體表無損傷、體重450±20 g/尾、體長(zhǎng)24.0±0.7 cm的健康成魚，暫養(yǎng)于室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（450 L）內(nèi)。暫養(yǎng)期間以鯪魚（體長(zhǎng)4.0±1.0 cm）為餌料，每2 d投餌1次，投喂量為翹嘴鱖體重的2倍;同時(shí)保持水體溶解氧含量6.5±0.2 mg/L、pH 7.55±0.20，水溫（22.0±0.5）℃。暫養(yǎng)14 d后進(jìn)行低氧脅迫試驗(yàn)。

1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

根據(jù)司亞東等（1995）、熊向英等（2016）的相關(guān)研究可知，魚類的飽和溶解氧濃度為7.0 mg/L，缺氧臨界值為4.0 mg/L，鱖魚成魚的溶解氧窒息點(diǎn)在l.0 mg/L左右?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)過程中，低于魚類缺氧臨界值可能會(huì)給翹嘴鱖養(yǎng)殖帶來影響，故設(shè)常氧對(duì)照組（溶解氧含量6.5±0.2 mg/L）和低氧試驗(yàn)組（溶解氧含量2.8±0.2 mg/L），每組設(shè)3個(gè)平行，即6個(gè)450 L的養(yǎng)殖桶，桶內(nèi)水體積約320 L。通過調(diào)節(jié)充入水中的氮?dú)夂涂諝馑俾矢淖兤淙芙庋鹾浚肏ACH-LDO溶氧儀檢測(cè)溶解氧變化情況，使溶解氧含量維持在預(yù)設(shè)值上。待對(duì)照組和試驗(yàn)組的水體溶解氧降至預(yù)設(shè)值并保持穩(wěn)定時(shí)，將180尾翹嘴鱖隨機(jī)平均放養(yǎng)到6個(gè)養(yǎng)殖桶內(nèi)（每桶30尾）。試驗(yàn)期間每2 h用HACH-LDO溶氧儀檢測(cè)并調(diào)整水體溶解氧含量，保持水體靜止，停止進(jìn)食，水溫（22.0±0.5）℃，pH 7.55±0.20。分別在低氧脅迫0、6、12、24、48和96 h時(shí)，每桶隨機(jī)選取3尾翹嘴鱖，以100 mg/L MS-222麻醉后解剖采集肝臟和鰓組織樣本，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 酶活性檢測(cè)

過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、乳酸脫氫酶（LDH）及超微量總ATP酶（ATPase）均采用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取0.1 g肝臟、鰓組織按重量體積比1∶9加入生理鹽水，制成10.0%組織勻漿，離心收集上清液制備待測(cè)溶液。其中，鰓組織再加10和100倍生理鹽水分別制成1.0%和0.1%組織勻漿，然后按試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。使用BioTek EonTM微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)讀數(shù)。

1. 4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取0.1 g翹嘴鱖肝臟置于RNAiso Plus[寶生物工程（大連）有限公司]中勻漿，按說明提取總RNA。以微量紫外分光光度計(jì)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)總RNA純度及完整性后，使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在NCBI中檢索HIF-1α（Hypoxia inducible factor-1alpha）、EPO（Erythropoietin）和HSP90α（Heat shock protein 90 alpha）基因序列，以β-actin為管家基因，利用Primer-BLAST程序設(shè)計(jì)引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán);60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。以2-ΔΔCt法換算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并以SPSS 22.0分別進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 急性低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖肝臟抗氧化酶活性的影響

由圖1可知，對(duì)照組翹嘴鱖肝臟CAT活性無顯著變化（P>0.05，下同），試驗(yàn)組翹嘴鱖在整個(gè)急性低氧脅迫過程中其肝臟CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟CAT活性在低氧脅迫初期持續(xù)升高但與對(duì)照組相比無顯著差異，至脅迫12 h時(shí)顯著升高（P<0.05，下同），CAT活性達(dá)最高值（40.13 U/mg），是對(duì)照組的1.70倍;隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，但至脅迫96 h時(shí)CAT活性仍顯著高于對(duì)照組。

由圖2可知，對(duì)照組翹嘴鱖肝臟GSH含量無顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖在整個(gè)急性低氧脅迫過程中其肝臟GSH含量變化趨勢(shì)與CAT活性相似，均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，但較CAT活性變化更明顯。低氧脅迫6 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟GSH含量顯著高于對(duì)照組，且呈持續(xù)升高趨勢(shì);至脅迫12 h時(shí)GSH含量達(dá)最高值（22.65 μmol/g），是對(duì)照組的6.24倍;隨后開始下降，但直至脅迫96 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟GSH含量仍顯著高于對(duì)照組。

由圖3可知，對(duì)照組翹嘴鱖肝臟GPT活性無顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖在整個(gè)急性低氧脅迫過程中其肝臟GPT活性變化也呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。在低氧脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟GPT活性與對(duì)照組間無顯著差異;至脅迫12 h時(shí)GPT活性顯著高于對(duì)照組，至脅迫48 h時(shí)GPT活性達(dá)最高值（12.93 U/g），是對(duì)照組的2.26倍;隨后開始下降，但直至脅迫96 h時(shí)GPT活性仍顯著高于對(duì)照組。

2. 2 急性低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖鰓組織呼吸相關(guān)酶活性的影響

由圖4可知，對(duì)照組翹嘴鱖鰓組織LDH活性無顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖在整個(gè)急性低氧脅迫過程中其鰓組織LDH活性呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。低氧脅迫6 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖鰓組織LDH活性達(dá)最高值（849.67 U/mg），是對(duì)照組的1.34倍，顯著高于對(duì)照組;隨后開始下降，至脅迫24 h時(shí)LDH活性達(dá)最低值（380.32 U/mg），顯著低于對(duì)照組;至脅迫96 h時(shí)LDH活性略有回升，但仍顯著低于對(duì)照組。

由圖5可知，對(duì)照組翹嘴鱖鰓組織ATPase活性無顯著變化，試驗(yàn)組翹嘴鱖在整個(gè)急性低氧脅迫過程中其鰓組織ATPase活性呈降低—升高—降低的變化趨勢(shì)。低氧脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖鰓組織ATPase活性顯著低于對(duì)照組，至脅迫24 h時(shí)達(dá)最低值（0.35 U/mg），僅為對(duì)照組的16%;隨后ATPase活性略有回升，但仍顯著低于對(duì)照組。

2. 3 急性低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，在整個(gè)急性低氧脅迫過程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)。低氧脅迫24 h內(nèi)，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組的差異均不顯著;從脅迫48 h起HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，至脅迫96 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，是對(duì)照組的9.57倍。

如圖7所示，在整個(gè)急性低氧脅迫過程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟EPO基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。低氧脅迫12 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟EPO基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，顯著高于對(duì)照組;隨后呈下調(diào)趨勢(shì)，但至脅迫24 h時(shí)EPO基因的相對(duì)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組;從脅迫48 h起，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟EPO基因的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異。

如圖8所示，在整個(gè)急性低氧脅迫過程中，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量呈升高—降低—升高—降低的波動(dòng)變化趨勢(shì)。低氧脅迫6 h時(shí)，試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，顯著高于對(duì)照組;隨后開始下調(diào)，至脅迫12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量開始與對(duì)照組持平;至脅迫48 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量又出現(xiàn)一個(gè)峰值，且顯著高于對(duì)照組，但至脅迫96 h時(shí)HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量又降至對(duì)照組水平。

3 討論

3. 1 翹嘴鱖肝臟抗氧化酶活性對(duì)急性低氧脅迫的響應(yīng)

需氧生物的正常新陳代謝均會(huì)產(chǎn)生少量活性氧自由基（ROS），參與其體內(nèi)的各種生理活動(dòng)。當(dāng)機(jī)體受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS大量積累而造成氧化損傷?？寡趸割愒谇宄嘤郣OS的過程中發(fā)揮重要作用（亢玉靜等，2013），CAT和GSH是抗氧化酶類的重要組成部分，是反映機(jī)體健康與否的重要指標(biāo)（梁俊平等，2019）。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫下翹嘴鱖肝臟的CAT活性和GSH含量均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。低氧脅迫6 h時(shí)翹嘴鱖肝臟GSH含量升高顯著高于對(duì)照組，至脅迫12 h時(shí)GSH含量達(dá)最高值;與此同時(shí)，翹嘴鱖肝臟CAT活性升高，至脅迫12 h時(shí)顯著高于對(duì)照組。說明低氧脅迫致使翹嘴鱖體內(nèi)的ROS含量升高，從而引起抗氧化酶系統(tǒng)誘導(dǎo)CAT活性和GSH含量升高，以清除體內(nèi)過多的ROS，將ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化程度控制在其生理可耐受范圍內(nèi)（Lushchak et al.，2001），保護(hù)機(jī)體不受損害，與陳世喜等（2016）的研究結(jié)果相似。至脅迫24 h時(shí)，翹嘴鱖肝臟CAT活性和GSH含量分別出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因低氧脅迫時(shí)間過長(zhǎng)，翹嘴鱖體內(nèi)的ROS得不到及時(shí)清除而大量積累，超過體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的耐受極限，致使抗氧化酶活性下降，與常志成等（2018）的研究結(jié)果相似。至脅迫96 h時(shí)，翹嘴鱖肝臟CAT活性和GSH含量雖然顯著高于對(duì)照組，但相對(duì)于脅迫12 h時(shí)明顯降低，其原因可能是翹嘴鱖體內(nèi)ROS含量已超過體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的耐受極限，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)受損，但仍具有抗氧化作用?？梢姡脱趺{迫前期翹嘴鱖體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)被激活，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗氧化酶系統(tǒng)雖然受到影響，但仍然繼續(xù)行使抗氧化功能。

GPT能催化氨基從丙氨酸向α-酮戊二酸轉(zhuǎn)移，形成谷氨酸和丙酮酸（劉沛，2014），其活性反映蛋白合成與分解代謝的狀況（李開放和徐奇友，2019），是判斷肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一（羅莎等，2016）。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫下翹嘴鱖肝臟GPT活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。低氧脅迫12 h時(shí)翹嘴鱖肝臟GPT活性顯著高于對(duì)照組，表明低氧脅迫導(dǎo)致翹嘴鱖體內(nèi)的ROS含量升高，雖然激活了抗氧化酶系統(tǒng)，但由于未能及時(shí)清除過多的ROS，致使肝細(xì)胞受損傷，GPT活性升高，與陳靜怡等（2018）的研究結(jié)果一致;同時(shí)說明CAT和GSH的協(xié)同作用對(duì)GPT的影響具有滯后性。在脅迫48 h時(shí)，GPT活性升高至最高值，表明隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大量ROS在體內(nèi)積累而得不到及時(shí)清除，嚴(yán)重影響抗氧化酶系統(tǒng)。至脅迫96 h時(shí)，可能是機(jī)體進(jìn)行自我調(diào)節(jié)后稍有恢復(fù)，GPT活性有所下降，但仍顯著高于對(duì)照組。

3. 2 翹嘴鱖鰓組織呼吸相關(guān)酶活性對(duì)急性低氧脅迫的響應(yīng)

LDH的功能是催化乳酸氧化形成丙酮酸，在糖酵解與有氧氧化的轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用（毛瑞鑫等，2009;揭小華等，2015），其活性反映機(jī)體的無氧呼吸代謝水平。鰓組織是魚類的呼吸器官，是溶解氧進(jìn)行氣體交換的場(chǎng)所（王曉雯等，2016）。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫6 h時(shí)試驗(yàn)組翹嘴鱖鰓組織LDH活性顯著高于對(duì)照組，但隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，與李根瑞（2016）的研究結(jié)果相似。說明在低氧脅迫下，翹嘴鱖通過無氧代謝為機(jī)體提供能量，并進(jìn)行自我生理調(diào)節(jié)恢復(fù)。無氧呼吸代謝能力增強(qiáng)，促進(jìn)乳酸積累，而積累的乳酸誘導(dǎo)LDH活性上升，形成一種調(diào)節(jié)機(jī)制。脅迫24～96 h，試驗(yàn)組翹嘴鱖鰓組織LDH活性略有回升但仍顯著低于對(duì)照組，與區(qū)又君等（2017）的研究結(jié)果基本吻合，可能是低氧脅迫時(shí)間過長(zhǎng)，機(jī)體為應(yīng)對(duì)低氧脅迫帶來的影響而將乳酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖，以維持機(jī)體酸堿平衡及葡萄糖供應(yīng)（Oliveira et al.，2004），從而引起乳酸含量下降;也可能是低氧脅迫已超出機(jī)體LDH的調(diào)節(jié)范圍，使其不能發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。

ATPase能將三磷酸腺苷（ATP）催化水解為二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根離子，釋放能量供給生命活動(dòng)，但ATPase的合成及活性均受外界溶解氧變化的影響（王曉雯等，2016）。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫下翹嘴鱖鰓組織ATPase活性呈降低—升高—降低的變化趨勢(shì)，且顯著低于對(duì)照組，與王春枝等（2014）的研究結(jié)果相似。王春枝等（2014）認(rèn)為在低氧條件下魚類能通過自我調(diào)節(jié)作用，促使ATPase活性升高，但溶解氧降至一定程度時(shí)，可能超過魚類自我調(diào)節(jié)的范圍，因此ATPase活性呈急速下降趨勢(shì)。在整個(gè)急性低氧脅迫過程中，LDH活性顯著低于對(duì)照組，可能也影響ATPase活性，究其原因可能是急性低氧脅迫時(shí)間過長(zhǎng)造成翹嘴鱖線粒體或線粒體內(nèi)膜的損傷，從而影響ATPase活性。

3. 3 翹嘴鱖低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因?qū)毙缘脱趺{迫的響應(yīng)

在缺氧條件下，基因表達(dá)變化主要由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF alpha）介導(dǎo)（Kalle et al.，2007）。其中，HIF-1α是低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，對(duì)調(diào)控低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑起重要作用，在多數(shù)高低等動(dòng)物體內(nèi)均有表達(dá)（肖武漢，2014）。孫俊霄等（2019）在黃顙魚低氧（溶解氧含量1.48±0.27 mg/L）脅迫24 h、張凱強(qiáng)等（2020）在花鱸低氧（溶解氧含量1.56±0.24 mg/L）脅迫12 h的研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因呈上調(diào)表達(dá)，但Geng等（2014）研究表明斑點(diǎn)叉尾鮰在低氧（溶解氧含量1.0 mg/L）脅迫下，HIF-1α基因在脅迫1.5 h時(shí)呈下調(diào)表達(dá)，至脅迫5.0 h時(shí)則上調(diào)表達(dá);Mu等（2015）研究發(fā)現(xiàn)許氏平鲉在低氧條件下其肝臟HIF-1α基因表達(dá)無顯著差異。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫48 h時(shí)翹嘴鱖肝臟HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量開始顯著上調(diào)，可能是本研究的溶解氧含量較高，翹嘴鱖肝臟HIF-1α信號(hào)通路在低氧脅迫前期未被激活，直至低氧脅迫48 h時(shí)才引起轉(zhuǎn)錄因子HIF累積，HIF-1α基因上調(diào)表達(dá)促使翹嘴鱖能量代謝由有氧向無氧轉(zhuǎn)變（王國善等，2014），以適應(yīng)低氧環(huán)境。

EPO是一種糖蛋白激素，具有促紅細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)功能（Chu et al.，2007）。周智涓等（2016）研究證實(shí)缺氧環(huán)境能影響B(tài)MSCs細(xì)胞EPO蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果也表明，低氧脅迫12 h時(shí)翹嘴鱖肝臟EPO基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，說明低氧誘導(dǎo)了機(jī)體低氧應(yīng)激反應(yīng)，通過上調(diào)EPO基因表達(dá)以促進(jìn)翹嘴鱖肝臟紅細(xì)胞的生成，進(jìn)而應(yīng)對(duì)缺氧導(dǎo)致的血氧能力下降，提高機(jī)體的低氧耐受能力。隨后EPO基因表達(dá)持續(xù)下調(diào)，至低氧脅迫48 h時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，可能是翹嘴鱖通過上調(diào)EPO基因表達(dá)而促使機(jī)體對(duì)氧氣的獲取能力和利用率有所提高，同時(shí)通過反饋機(jī)制抑制EPO基因生成，維持紅細(xì)胞正常水平，以獲得生命活動(dòng)需要的氧氣，使機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致EPO基因表達(dá)下調(diào)，與趙永麗等（2018）的研究結(jié)論一致。HIF-1α基因和EPO基因具有協(xié)同作用，但在急性低氧脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)不同步，可能是二者的響應(yīng)過程及承擔(dān)功能不同，也可能是存在一定的組織特異性，具體原因有待進(jìn)一步探究。

HSP（熱休克蛋白）是一整套高度保守的蛋白，除熱應(yīng)激外，缺氧、局部缺血、毒素等均會(huì)促使其上調(diào)表達(dá)（Roberts et al.，2010）。HSP90家族是HSP最重要的基因家族，常被用作環(huán)境脅迫因子的分子生物標(biāo)志物（劉童，2015）。本研究結(jié)果表明，低氧脅迫后翹嘴鱖肝臟HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，說明肝臟在低氧脅迫下受到影響，機(jī)體通過上調(diào)HSP90α基因表達(dá)而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用;隨后其相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，可能是HSP90α基因表達(dá)上調(diào)發(fā)揮作用，使機(jī)體能適應(yīng)低氧環(huán)境，與徐賀（2015）的研究結(jié)果相似。至脅迫48 h時(shí)HSP90α基因的相對(duì)表達(dá)量又出現(xiàn)一個(gè)峰值，且顯著高于對(duì)照組，可能是隨低氧脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，再次激活機(jī)體氧化應(yīng)激效應(yīng)，保護(hù)肝臟細(xì)胞，與王曉雯等（2019）研究發(fā)現(xiàn)急性熱應(yīng)激下西伯利亞鱘幼魚肝臟受到影響但脅迫96 h后能恢復(fù)的結(jié)果相似。

4 結(jié)論

急性低氧脅迫對(duì)翹嘴鱖肝臟抗氧化酶、鰓組織呼吸相關(guān)酶及低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)均產(chǎn)生顯著影響。雖然翹嘴鱖能通過自我調(diào)節(jié)抗氧化酶和呼吸相關(guān)酶活性及上調(diào)低氧誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，促使機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境，但養(yǎng)殖水體溶解氧降至2.8 mg/L以下即對(duì)翹嘴鱖產(chǎn)生不利影響，因此在實(shí)際養(yǎng)殖過程中須密切關(guān)注養(yǎng)殖水體溶解氧變化。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）