和華龍++黃華++薛建輝

摘要：以水葫蘆為研究對(duì)象，利用水培法，探討了模擬酸雨和富營養(yǎng)化復(fù)合脅迫對(duì)水葫蘆葉片抗氧化酶的影響。結(jié)果表明，隨著酸雨pH值的下降和富營養(yǎng)化水平的提高，水葫蘆葉片的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性總體均呈下降趨勢(shì)，而過氧化物酶（POD）活性呈上升趨勢(shì)，并且3種酶活性的變化幅度越來越大。表明隨著pH值的下降，酸雨對(duì)SOD、CAT活性均產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)POD活性產(chǎn)生促進(jìn)作用，并且會(huì)隨著富營養(yǎng)化水平的提高作用增強(qiáng)。并對(duì)3種酶活性變化進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)三者相關(guān)系數(shù)較大，說明3種酶之間有一定的協(xié)調(diào)作用。

關(guān)鍵詞：模擬酸雨；富營養(yǎng)化；復(fù)合脅迫；水葫蘆；抗氧化酶

中圖分類號(hào)： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0430-03

收稿日期：2015-05-11

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（編號(hào)：12KJA180003）；江蘇省高校生物學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程（編號(hào)：2014-PAPD）。

作者簡(jiǎn)介：和華龍（1989—），男，河南周口人，碩士研究生，主要從事植物生理學(xué)研究。E-mail：hualonghe@foxmail.com。

通信作者：薛建輝，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林生態(tài)學(xué)研究。Tel：（025）85427220；E-mail：jhxue@njfu.edu.cn。中國是繼歐美之后世界上出現(xiàn)的第三大酸雨區(qū)，酸雨面積約占國土面積的40%[1]，而富營養(yǎng)化湖泊的比例更是高達(dá)60%[2]。酸雨和富營養(yǎng)化的危害日益嚴(yán)重，對(duì)我國的生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和居民健康造成了巨大威脅[3]。研究酸雨和富營養(yǎng)化復(fù)合脅迫對(duì)水生植物的影響，探索水生植物在富營養(yǎng)化條件下對(duì)酸雨的響應(yīng)機(jī)制，從而選擇合適的水生植物用于水環(huán)境修復(fù)，具有十分重要的意義。在逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，自由基大量積累，可導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷，進(jìn)一步造成細(xì)胞的代謝功能喪失和死亡[4-5]。植物體內(nèi)存在一整套的抗氧化系統(tǒng)，它能使活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，從而維持植物的正常生長[6-7]。其中，抗氧化酶發(fā)揮著重要作用，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）[8-9]。目前，國內(nèi)外關(guān)于酸雨對(duì)植物影響的研究較多，但是酸雨和富營養(yǎng)化復(fù)合脅迫對(duì)植物抗氧化酶系統(tǒng)的影響則鮮見報(bào)道[10]。本研究以水葫蘆為對(duì)象，利用水培法，探討了在富營養(yǎng)化條件下酸雨對(duì)水葫蘆葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響，以期為富營養(yǎng)化水體的生態(tài)修復(fù)以及適宜水生植物的選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

水葫蘆，學(xué)名鳳眼藍(lán)（Eichhornia crassipes），原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，雨久花科鳳眼藍(lán)屬，是一種漂浮性水生植物。水葫蘆根系發(fā)達(dá)呈須狀，葉柄膨大而中空，葉子直立而光滑，花為藍(lán)色喇叭狀。水葫蘆適應(yīng)性強(qiáng)，是凈化水質(zhì)的良好植物，但其繁殖迅速，難以根除，會(huì)導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化[11]。試驗(yàn)在南京林業(yè)大學(xué)下蜀林場(chǎng)溫室內(nèi)進(jìn)行，選取生長健康并且一致的水葫蘆幼苗置于塑料周轉(zhuǎn)箱（長50 cm、寬38 cm、 高30 cm） ，箱內(nèi)盛30 L營養(yǎng)液。

1.2方法

1.2.1營養(yǎng)液營養(yǎng)水平設(shè)置營養(yǎng)液采用Hoagland改良配方，以處理過的高純水配制。水培1個(gè)月后，選取生長健康并且一致的水葫蘆分為3組，再分別用不同營養(yǎng)水平的營養(yǎng)液培養(yǎng)。營養(yǎng)液設(shè)置低富營養(yǎng)化（N1）、中富營養(yǎng)化（N2）、高富營養(yǎng)化（N3）3個(gè)水平，其中鐵鹽和微量元素的配方與Hoagland營養(yǎng)液一致。各營養(yǎng)液的成分和含量見表1。

1.2.2模擬酸雨處理水平設(shè)置酸雨母液采用1 mol/L硫酸與2 mol/L硝酸等體積混合而成，以處理過的高純水配制。模擬酸雨設(shè)置3個(gè)水平，分別為pH值7.0、4.0、2.0。模擬酸雨處理采用噴霧法，用噴霧器向水葫蘆葉片噴灑酸雨。在葉面噴灑酸雨量為20 mm（相當(dāng)于中雨），噴灑時(shí)間為30 min。噴灑酸雨時(shí)須緩慢，以葉片不滴液為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)為防止污染營養(yǎng)液，噴后更換營養(yǎng)液。每組水葫蘆樣品噴灑模擬酸雨3次，隔1 d噴1次，處理完成后的第2天，隨機(jī)選取新鮮葉片進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3生理指標(biāo)測(cè)定參考李合生的方法[12]，分別測(cè)定水葫蘆葉片的SOD、CAT、POD活性。SOD活性以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原50%為1個(gè)酶活性單位（U/g），CAT活性以D240 nm每分鐘減少0.1為1個(gè)酶活性單位[U/（g·min）]，POD活性以D470 nm每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活性單位 [U/（g·min）]。每組水葫蘆樣品測(cè)定3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)均取自不同的樣品。

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合脅迫對(duì)SOD活性的影響

從圖1可見，模擬酸雨處理后，SOD活性在pH值4.0水平下高于pH值7.0水平，在pH值2.0水平下低于pH值7.0水平。同時(shí)SOD活性在N2水平下低于N1水平，在N3水平下低于N2水平。且SOD活性從N2水平至N3水平下降的幅度要大于從N1水平至N2水平下降的幅度。由此可見，同等營養(yǎng)水平下，隨著pH值的下降，SOD活性先上升后下降，總體呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，同等酸雨水平下，隨著營養(yǎng)水平的提高，SOD活性呈下降趨勢(shì)，并且下降幅度越來越大。表明酸雨脅迫和富營養(yǎng)化脅迫對(duì)水葫蘆葉片SOD活性均有一定的抑制作用，而且富營養(yǎng)化脅迫擴(kuò)大了酸雨脅迫的不利影響。

2.2復(fù)合脅迫對(duì)CAT活性的影響

從圖2可見，模擬酸雨處理后，CAT活性在pH值40水平下高于pH值7.0水平，在pH值2.0水平下低于pH值7.0水平。同時(shí)CAT活性在N2水平下低于N1水平，在N3水平下低于N2水平。且CAT活性從N2水平至N3水平下降的幅度要大于從N1水平至N2水平下降的幅度。由此可見，同等營養(yǎng)水平下，隨著pH值的下降，CAT活性先上升后下降，總體呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，同等酸雨水平下，隨著富營養(yǎng)化水平的提高，CAT活性呈下降趨勢(shì)，并且下降幅度越來越大。表明酸雨脅迫和富營養(yǎng)化脅迫對(duì)水葫蘆葉片CAT活性均有一定的抑制作用，而且富營養(yǎng)化脅迫擴(kuò)大了酸雨脅迫的不利影響。

2.3復(fù)合脅迫對(duì)POD活性的影響

從圖3可見，模擬酸雨處理后，POD活性在pH值4.0水平下高于pH值7.0水平，在pH值2.0水平下高于pH值4.0水平。同時(shí)POD活性在N2水平下高于N1水平，在N3水平下高于N2水平。且POD活性從N2水平至N3水平升高的幅度要大于從N1水平至N2水平升高的幅度。由此可見，隨著pH值的下降和富營養(yǎng)化水平的提高，POD活性均呈上升趨勢(shì)，并且上升幅度越來越大。表明酸雨脅迫和富營養(yǎng)化脅迫對(duì)水葫蘆葉片POD活性均有一定的促進(jìn)作用，而且富營養(yǎng)化脅迫擴(kuò)大了酸雨脅迫的不利影響。

2.4SOD、CAT與POD活性變化的相關(guān)性分析

從表2可以看出，對(duì)SOD、CAT與POD 3種酶活性的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，分析結(jié)果相關(guān)系數(shù)較大。其中，SOD與CAT活性呈極顯著正相關(guān)，SOD與POD活性呈不顯著負(fù)相關(guān)，CAT與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)。表明SOD、CAT與POD之間存在一定的協(xié)調(diào)作用。

表2SOD、CAT、SOD活性變化的相關(guān)系數(shù)

指標(biāo)SODCATPODSOD1.000CAT0.9971.000POD-0.773-0.7901.000

3討論

研究結(jié)果表明，酸雨會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)超氧陰離子自由基（O-2· ）等活性氧大量積累，對(duì)蛋白質(zhì)、糖脂和核酸等維持生物功能的大分子結(jié)構(gòu)造成破壞，特別是膜結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，膜透性增加，大量營養(yǎng)離子外滲，從而影響了植物正常的生理代謝[13-14]。酸雨對(duì)許多植物產(chǎn)生傷害的臨界點(diǎn)在pH值3.5，對(duì)植物生長和生物量影響的臨界點(diǎn)在pH值3.0至pH值2.0之間[15]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相符。

SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，可以催化 O-2· 發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2[16]。SOD作為一種誘導(dǎo)酶，其活性受底物 O-2· 濃度的影響[17]。本試驗(yàn)中隨著酸雨pH值的下降，SOD活性先上升后下降，總體呈下降趨勢(shì)。表明酸雨處理后，水葫蘆葉片中 O-2· 產(chǎn)生增多，促進(jìn)了SOD活性的增強(qiáng)；但隨著pH值進(jìn)一步下降，SOD活性逐漸受到抑制[18]。

CAT主要存在于過氧化氫體中，可將H2O2迅速分解為H2O和O2[19]。CAT和SOD協(xié)同作用，可清除植物體內(nèi)過量的 O-2· 和H2O2[20]。本試驗(yàn)中，隨著酸雨pH值的下降，CAT活性先上升后下降，總體呈下降趨勢(shì)。表明酸雨處理后，水葫蘆葉片中由SOD催化產(chǎn)生的H2O2增多，促進(jìn)了CAT活性增強(qiáng)；但隨著pH值進(jìn)一步下降，CAT活性逐漸受到抑制[21]。

POD廣泛存在于植物體內(nèi)，可以將H2O2分解為H2O和O2[22]。POD作為活性較高的適應(yīng)性酶，能夠反映植物生長發(fā)育的特點(diǎn)、體內(nèi)代謝狀況以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性，是植物衰老到一定階段的產(chǎn)物，甚至可以作為衰老指標(biāo)[23]。本試驗(yàn)中隨著酸雨pH值的下降，POD活性呈上升趨勢(shì)。表明酸雨處理后，水葫蘆葉片中H2O2的產(chǎn)生增多，促進(jìn)了POD活性的增強(qiáng)，POD在初期表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)。但隨著pH值進(jìn)一步下降，POD參與了活性氧的生成和葉綠素的降解，并引發(fā)脂質(zhì)過氧化，雖然活性繼續(xù)增強(qiáng)，但是表現(xiàn)為傷害效應(yīng)[24]。

目前有關(guān)富營養(yǎng)化對(duì)植物造成傷害的機(jī)理的研究較少。一般認(rèn)為，富營養(yǎng)化造成浮游生物和細(xì)菌大量繁殖，導(dǎo)致水體透明度降低，下層水體植物的光合作用受到影響[25]。此外，藻類死亡后不斷沉積，腐爛分解，釋放有毒物質(zhì)，同時(shí)消耗大量溶解氧，致使需氧生物難以生存[26]。最后，隨著富營養(yǎng)化程度的增加，水體不斷惡化，水生環(huán)境失去平衡[27]。

本試驗(yàn)中，隨著富營養(yǎng)化水平的提高，SOD、CAT活性均呈下降趨勢(shì)，POD活性呈上升趨勢(shì)，并且三者的變化幅度越來越大。表明富營養(yǎng)化脅迫抑制了SOD、CAT活性，促進(jìn)了POD活性，而且富營養(yǎng)化脅迫擴(kuò)大了酸雨脅迫的不利影響[28]。

對(duì)SOD、CAT與POD這3種酶活性的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，SOD與CAT活性呈極顯著正相關(guān)，CAT與POD活性呈顯著負(fù)相關(guān)。表明酸雨處理后，水葫蘆葉片中 O-2· 增多，首先SOD將 O-2· 分解為H2O2和O2，然后CAT將H2O2繼續(xù)分解為H2O和O2。SOD與CAT協(xié)調(diào)作用，共同清除了水葫蘆葉片中過量的活性氧。但是當(dāng)pH值進(jìn)一步下降時(shí)，SOD與CAT活性受到抑制，而POD參與到活性氧的生成中，活性繼續(xù)上升。

綜上所述，由于抗氧化酶的作用，水葫蘆對(duì)于pH值較高的酸雨有一定的耐受性，而對(duì)pH值較低的酸雨則會(huì)受到傷害。此外，酸雨還會(huì)影響水葫蘆對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，加劇水體的富營養(yǎng)化進(jìn)程，而富營養(yǎng)化又會(huì)擴(kuò)大酸雨的不利影響。水葫蘆抵抗酸雨脅迫的臨界pH值尚不確定。酸雨和富營養(yǎng)化復(fù)合脅迫對(duì)水葫蘆抗氧化酶的影響可以通過抗氧化酶活性的變化來分析，但其具體生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

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