晏權 任明見 李振華 徐如宏

摘要：【目的】篩選出小麥籽粒低多酚氧化酶（PPO）活性的種質資源，為貴州小麥籽粒品質的遺傳改良及育種提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳陨a(chǎn)中表現(xiàn)優(yōu)異的135份貴州小麥品種（系）為材料，采用苯酚染色法進行染色，在此基礎上以STS分子標記（PPO16、PPO18和PPO29）檢測小麥PPO活性相關基因，并通過Fragment AnalyzerTM毛細管電泳鑒定相關基因，進而對小麥籽粒低PPO活性基因的組成進行鑒定和篩選?！窘Y果】135份小麥材料籽粒經(jīng)苯酚染色后，有4份材料未染色（A級），9份呈淺綠色（B級），65份材料呈棕色（C級），57份材料呈黑色（D級）。STS分子標記檢測結果表明，在A級和B級材料中檢測到10份材料含Ppo-A1b基因、4份材料含Ppo-D1a基因，其中4份材料同時含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因，分別是貴麥2號、惠水1-23、石無芒和08-9選單-2-7;在C級材料中檢測到3份材料含Ppo-A1b基因、17份材料含Ppo-D1a基因，其中1份材料（貴農(nóng)08-9）同時含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因;在D級材料中均未檢測到Ppo-A1b和Ppo-D1a基因。【結論】采用苯酚染色法結合STS分子標記檢測可對小麥籽粒是否含低PPO活性基因進行準確鑒定。貴麥 2號、惠水1-23、石無芒、08-9選單-2-7和貴農(nóng)08-9等5份含有雙低PPO活性基因（Ppo-A1b/Ppo-D1a）的種質資源，可作為親本材料直接用于小麥籽粒低PPO活性遺傳改良及新品種選育。

關鍵詞： 小麥;多酚氧化酶（PPO）活性;苯酚染色法;STS分子標記

0 引言

【研究意義】小麥籽粒中的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性與面食加工產(chǎn)品色澤變化密切相關，直接影響著面粉和面食制品的品質及商品價值（司紅起，2008）。顏色是評價面食制品的重要指標，也是小麥品質遺傳改良的重要目標（孫道杰等，2005）。面食制品在醒面和保存期間發(fā)生褐變，主要是由于籽粒中的內(nèi)源酚酸被PPO氧化，且自身多肽氨基基團聚合而形成褐色多聚體酚類物質，導致其品質變差（何克勤，2006;鄭文寅等，2013）。培育和選擇低PPO活性的小麥品種（系）是改良小麥相關品質性狀及防止其面食制品顏色發(fā)生褐變的有效方法（楊雪等，2014;Mangini et al.，2014;Rodriguez-Suarez and Atienza，2014），而從眾多小麥材料中篩選出低PPO活性的種質資源是進行小麥面食制品外觀品質改良的關鍵?！厩叭搜芯窟M展】小麥加工過程中面粉顏色會發(fā)生褐變，其中50%～70%的褐變由籽粒中的PPO所造成（常成等，2007）。Jukanti等（2004）通過分析小麥籽粒cDNA文庫中的EST（Expression sequence tags）序列CA716843，得到一段與PPO基因緊密聯(lián)系的序列。孫道杰等（2005）在此基礎上篩選出一對存在191 bp片段差異的引物，并最終開發(fā)出適用于小麥籽粒PPO活性輔助選擇的SSR分子標記（PPO18）。此外，有研究表明，控制普通小麥籽粒PPO活性表型變異的兩個主效基因分別位于2AL和2DL染色體上（張立平等，2005;Raman et al.，2005;Fuerst et al.，2006）。He等（2007）利用電子克隆技術對國內(nèi)普通小麥進行研究時獲得一對等位基因，將其命名為Ppo-A1和Ppo-D1，并根據(jù)克隆的基因設計互補顯性標記PPO16和PPO29，同時發(fā)現(xiàn)這對基因分別控制著小麥籽粒PPO活性，其中，Ppo-A1b和Ppo-D1a基因類型為低活性，Ppo-A1a和Ppo-D1b基因類型為高活性。肖永貴等（2008）運用PPO18、PPO16和PPO29等3個分子標記對我國4個麥區(qū)的冬小麥品種（系）進行PPO基因檢測，結果證實這3個分子標記的檢測方法操作簡便，且效果穩(wěn)定，能很好地反應PPO活性。孫樹貴等（2013）研究也發(fā)現(xiàn)使用分子檢測技術能準確鑒定小麥PPO活性。目前，PPO活性的測定方法主要有染色法、分光光度法、色譜法和精密計時測定法等（司紅起，2008;祝梓博，2017）。孫家柱等（2010）利用苯酚染色法對小麥進行PPO活性檢測和分級，證實該方法費用成本低、操作簡便、鑒別力較強且結果重復性好，可在實際生產(chǎn)中特別是基層推廣應用;此外，通過與分子標記結果對比，發(fā)現(xiàn)苯酚染色結果能更好地反映PPO活性，尤其是低PPO活性材料（孫家柱等，2012）。因此，采用染色法與分子檢測技術相結合的檢測方法更有利于低PPO活性小麥品種（系）育種工作的開展?！颈狙芯壳腥朦c】選育低PPO活性小麥種質資源是改良小麥籽粒性狀和品質育種的重要途徑，但目前有關貴州小麥籽粒PPO活性的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵性問題】采用苯酚染色法結合STS分子標記檢測對生產(chǎn)中表現(xiàn)優(yōu)異的135份小麥品種（系）籽粒PPO活性基因組成進行鑒定，旨在篩選出含有低PPO活性的種質資源，為貴州小麥籽粒品質的遺傳改良及育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的135份小麥材料（表1）部分由國家小麥改良中心貴州分中心選育提供，其他材料則從貴州省貴陽、興義、安順和惠水等地收集。DNF-910 dsDNA Kit/s試劑盒購自成都百樂科技有限公司;2×Taq PCR MasterMix反應試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司;D2000 DNA Marker購自貴州彌勒天根生物科技有限公司;50×TAE溶液購自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器設備：Genova Nano分光光度計（Jenway，英國）、T100TM_Thermal Cycler PCR儀（BIO-RAD，美國）、Fragment AnalyzerTM全自動毛細管電泳系統(tǒng)（AATI，美國）、高速離心機（Thermo，美國）、水平電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠）、電泳儀（DYY-6C，北京六一生物技術有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津泰斯特儀器有限公司）、高速冷凍離心機（Thermo，美國）和搖床（GS-20，杭州米歐儀器有限公司）。

1. 2 小麥籽粒苯酚染色檢測

參照孫家柱等（2010）的方法進行苯酚染色檢測。選取15粒小麥籽粒置于培養(yǎng)皿中，加水浸泡約18 h，吸干水后加入0.2%苯酚溶液，于室溫下靜置4 h后目測籽粒的染色情況，對其PPO活性水平進行分級記錄。所有苯酚染色于同一時間內(nèi)（含2次重復）完成，根據(jù)籽粒染色程度按不染色、淺綠色、棕色和黑色，分別判定為A、B、C和D級。

1. 3 基因組DNA提取及STS分子標記檢測

采用CTAB法提取供試小麥葉片DNA（徐如宏等，2005），以分光光度計檢測其濃度和純度，保證OD260/OD280約為1.8，然后稀釋至100 ng/μL作為模板備用。利用位于2A和2D染色體上的STS分子標記PPO16、PPO18和PPO29檢測小麥PPO活性相關基因，引物序列及相關信息詳見表2。PCR反應體系20.0 μL：含2×Taq PCR MaserMix 7.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，60/64 ℃ 45/50 s，72 ℃ 1 min，進行37/40個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖體系0.5×TAE，120 V下電泳50 min，于紫外燈下觀察、照相并記錄。

1. 4 Fragment AnalyzerTM毛細管電泳檢測

根據(jù)目標條帶的范圍選擇DNF-910-FR（35-1500 bp）試劑盒進行Fragment AnalyzerTM毛細管電泳檢測，將PCR擴增產(chǎn)物加入到樣品槽中，按Fragment AnalyzerTM全自動毛細管電泳檢測儀操作規(guī)程進行運行，電泳結束后以PROSize 3.0進行分析。

2 結果與分析

2. 1 苯酚染色結果分析

利用苯酚染色法浸染135份小麥材料籽粒，結果表明，4份材料未染色（圖1-A），為A級;9份呈淺綠色（圖1-B），為B級，說明這13份染色較淺的材料攜帶低PPO活性基因的可能性較大;65份材料呈棕色（圖1-C），為C級;57份材料呈黑色（圖1-D），為D級，說明這122份材料攜帶低PPO活性基因的可能性較小。

2. 2 PPO基因分子標記檢測結果

2. 2. 1 Ppo-A1位點基因型分布 利用PPO18分子標記檢測Ppo-A1位點基因，擴增產(chǎn)物大小分別為685 bp（高PPO活性）和876 bp（低PPO活性），對應的等位變異類型為Ppo-A1a和Ppo-A1b（陳杰等，2013）。本研究的擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測在750 bp附近出現(xiàn)兩條條帶（圖2），以Fragment AnalyzerTM毛細管電泳檢測可知這兩條條帶對應為685 bp（圖3-A）和876 bp（圖3-B），說明利用PPO18分子標記可檢測Ppo-A1基因等位變異類型。在135份小麥材料中，有37份材料擴增出685 bp的條帶，為Ppo-A1a等位變異類型;13份材料擴增出876 bp的條帶，為Ppo-A1b等位變異類型;其他材料未擴增出任何條帶，即未含Ppo-A1a和Ppo-A1b等位變異類型。綜上所述，135份材料中含有Ppo-A1b基因類型（低PPO活性）的材料較少，僅13份（占9.63%），分別是分枝麥5號、貴麥2號、貴農(nóng)10-6、惠水1-23、豐優(yōu)8號、石無芒、08-9選單-2-7、貴農(nóng)08-6-3、TP08-6-8、貴農(nóng)08-6-2-1、貴農(nóng)08-9、張10選-4和豐優(yōu)5號。

2. 2. 2 Ppo-D1位點基因型分布 在Ppo-D1位點上，STS分子標記引物PPO16可擴增出713 bp的Ppo-D1a基因片段，而引物PPO29無任何擴增產(chǎn)物;STS分子標記引物PPO29可擴增出490 bp的Ppo-D1b基因片段，而引物PPO16無任何擴增產(chǎn)物（陳杰等，2013）?？梢姡糜跈z測Ppo-D1位點的STS分子標記PPO16和PPO29可相互補充和驗證。本研究的擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測在700和500 bp附近分別出現(xiàn)明顯的條帶（圖4-A和圖4-B），以Fragment AnalyzerTM毛細管電泳檢測可知這兩條帶對應為713 bp（圖5-A）和490 bp（圖5-B）。在135份小麥材料中，有66份材料擴增出490 bp的條帶，為Ppo-D1b等位變異類型;21份材料擴增出713 bp的條帶，為Ppo-D1a等位變異類型;其他材料未檢測到含Ppo-D1a和Ppo-D1b等位變異類型。綜上所述，135份材料中含有Ppo-D1a基因類型（低PPO活性）的材料21份（占15.56%），分別是貴麥2號、惠水1-23、石無芒、08-9選單-2-7、163選-1、興育206、TP中分08-6選-11、貴農(nóng)33-12、貴農(nóng)08-9、貴農(nóng)08-7-3、XU-5-2、安2014-4、10-4-3-1、吉麥1號、黔990315、張07-10-6、張08-1-2-1、Y-4-1、貴麥1號、163-25和張10選42。

2. 2. 3 Ppo-A1和Ppo-D1位點基因型分布 135份小麥材料的Ppo-A1和Ppo-D1基因位點檢測結果如表3所示。2個位點基因類型共有4種，分別為Ppo-A1a/Ppo-D1a（中間型）、Ppo-A1b/Ppo-D1b（中間型）、Ppo-A1a/Ppo-D1b（高PPO活性）和Ppo-A1b/Ppo-D1a（低PPO活性）。4種等位變異類型的小麥材料分別有3、3、24和5份，其余材料只檢測到單個基因或未檢測到任何PPO基因?？梢姡?35份小麥籽粒中大多數(shù)材料不含PPO基因或含單個基因類型，具有雙低PPO活性類型的材料僅有5份，分別是貴麥2號、惠水1-23、石無芒、08-9選單-2-7和貴農(nóng)08-9。

對比苯酚染色結果和STS分子標記檢測結果，發(fā)現(xiàn)在苯酚染色較淺（A級和B級）的13份材料中有10份材料含Ppo-A1b基因，4份材料含Ppo-D1a基因，其中4份材料同時含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因;苯酚染色較深的C級材料中檢測到3份材料含Ppo-A1b基因、17份材料含Ppo-D1a基因，其中1份材料同時含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因;染色最深的D級材料中均未檢測到Ppo-A1b或Ppo-D1a基因。綜合兩種鑒定結果（表3）可知，共有13份材料含有Ppo-A1b基因、21份材料含Ppo-D1a基因，其中5份材料同時含Ppo-A1b/Ppo-D1a基因，分別來自A、B、C級材料。

3 討論

苯酚染色是目前最常用的底物染色法。孫家柱等（2012）研究表明，級別為0、1和2級的材料中PPO基因的雙低組合占92.9%，特別是對低PPO活性材料的選擇，苯酚染色結果與基因型分子標記檢測結果幾乎完全吻合。本研究結果表明，STS分子標記檢測到13份材料含有Ppo-A1b基因，其中10份材料來自苯酚染色較淺的A級和B級材料，而苯酚染色最深的D級材料中均未檢測到Ppo-A1b基因，與張立平等（2005）、孫家柱等（2012）的研究結論基本一致，說明含有Ppo-A1b基因的材料相對其他基因而言，其苯酚染色程度均不高。但需要注意的是，苯酚染色法鑒定過程中由于染色程度接近，在劃分B級和C級時可能會造成主觀判斷誤差。在本研究中有3份含Ppo-A1b基因的材料來自染色較深的C級，其中還有1份材料（貴農(nóng)08-9）同時含有Ppo-A1b/Ppo-D1a基因，因而對于染色較深的C級材料有必要利用分子標記做進一步鑒定。此外，Mangini等（2014）在四倍體小麥中開發(fā)了新標記MG18，且認為與PPO18分子標記相比，MG18分子標記能有效檢測四倍體小麥Ppo-A1位點上的4個不同等位基因[Ppo-A1b（低活性）、Ppo-A1e（高活性）、Ppo-A1f（高活性）和Ppo-A1g（低活性）]的分布情況，在針對不同小麥材料的PPO活性基因篩選時可結合這一分子標記進行分子鑒定，以提高選擇的準確性。因此，在實際工作中，可利用苯酚染色法對小麥籽粒PPO活性進行初篩，淘汰染色最深的D級材料后，再利用更有效的多種分子標記確認A、B、C級材料中PPO活性基因的組成，進而降低成本和提高育種工作效率。

本研究共篩選到含有低PPO活性基因的材料29份，占21.48%，其中含有雙低PPO活性基因的材料5份，占3.70%。說明這批篩選的小麥材料中含有雙低PPO活性基因的種質資源較少，與蘆靜等（2012）在新疆地區(qū)、陳杰等（2013）在黃淮地區(qū)的研究結果基本一致。對于含有雙低PPO活性基因的材料，可直接作為品質改良的親本材料應用于小麥品質育種研究，而其他含有單個低PPO活性基因的材料可通過復交方式進一步選育出含有雙低PPO活性基因的種質材料。此外，今后有必要加大對含有雙低PPO活性基因種質資源的引進，為選育含雙低PPO活性基因的小麥品種提供支撐。

4 結論

采用苯酚染色法結合STS分子標記檢測可對小麥籽粒是否含低PPO活性基因進行準確鑒定。貴麥2號、惠水1-23、石無芒、08-9選單-2-7和貴農(nóng)08-9等5份含有雙低PPO活性基因（Ppo-A1b/Ppo-D1a）的種質資源，可作為親本材料直接用于小麥籽粒低PPO活性遺傳改良及新品種選育。

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（責任編輯 蘭宗寶）