楊月月+遲德富+宇佳

摘 要 向培養(yǎng)了7 d的匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)分別添加0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L的ABA，以研究ABA對匍枝筋骨草細(xì)胞防御系統(tǒng)的作用及ABA對蛻皮激素合成的影響.試驗結(jié)果表明：向培養(yǎng)7 d的懸浮體系中，添加0.1～0.4 mg/L的ABA后，懸浮細(xì)胞第4天出現(xiàn)褐化；添加0.5 mg/L的ABA后，第3天出現(xiàn)懸浮細(xì)胞褐化現(xiàn)象；添加不同質(zhì)量濃度的ABA后第4天測其懸浮細(xì)胞生長量均與對照差異不顯著；添加不同質(zhì)量濃度ABA后懸浮細(xì)胞的SOD，POD 和CAT活性在48 h內(nèi)均顯著上升，而PAL活性變化在2～24 h間不顯著，后上升；添加不同質(zhì)量濃度的ABA可使筋骨草懸浮細(xì)胞的蛻皮激素含量增高，而添加0.1 mg/L ABA，其蛻皮激素含量增高最為顯著.

關(guān)鍵詞 匍枝筋骨草；β-蛻皮甾酮；ABA；抗氧化酶

中圖分類號 S567239 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2537（2015）03-0016-06

筋骨草，唇形目（Lamiales）唇形科（Lamiaceae）筋骨草屬（Ajuga）植物，一年或二年生草本，高10～30 cm，原產(chǎn)歐亞大陸[1]，我國南方地區(qū)主產(chǎn).筋骨草的主要次生代謝物為脫皮甾酮、杯莧甾酮、筋骨草甾酮B和C、筋骨草糖、筋骨草內(nèi)酯、黃酮甙、皂甙及生物堿等[2].國內(nèi)外對匍枝筋骨草的研究主要集中在醫(yī)藥與昆蟲方面.在醫(yī)藥上匍枝筋骨草具有清熱解毒，涼血平肝的作用.用于治療上呼吸道感染，扁桃體炎，支氣管炎，咽炎，肺炎，胃腸炎，肝炎，闌尾炎，高血壓等；外用可治跌打損傷，癰癤瘡瘍[3].在害蟲控制方面，匍枝筋骨草蛻皮激素含量較高，提取的植物源蛻皮激素具有良好的殺蟲效果[4]，可用于植物源殺蟲劑和生長調(diào)節(jié)劑的制作，具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)境保護(hù)的價值.

脫落酸（Abscisic Acid，ABA）是一類抑制生長，促進(jìn)植物休眠的植物激素，又稱S-誘抗素，也有“逆境激素”之稱[5].將ABA加入細(xì)胞培養(yǎng)體系后，會介導(dǎo)植物細(xì)胞依次發(fā)生信號識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理生化水平的變化[6]，在逆境條件下ABA含量增高，提高植物抗性.在體系中添加ABA，ABA含量也會增高.近年研究發(fā)現(xiàn)，逆境條件下ABA在植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物中具有調(diào)控作用，可以誘導(dǎo)綠原酸、酚類、黃酮類和萜類物質(zhì)的增加[7].但ABA直接誘導(dǎo)細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物卻未見報道.

ABA是一種對人畜無害，新型高效，天然的植物生長活性物質(zhì).本文在匍枝筋骨草懸浮體系中研究ABA對匍枝筋骨草細(xì)胞防御系統(tǒng)的作用及對蛻皮激素合成的影響，為揭示ABA調(diào)控筋骨草懸浮細(xì)胞合成蛻皮激素的機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 試驗與方法

1.1 試驗材料

試驗選取東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院森林生物工程實驗室培養(yǎng)的懸浮匍枝筋骨草進(jìn)行繼代培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 懸浮細(xì)胞的培養(yǎng) 采用趙曉杰等[8]方法.將筋骨草在固體培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.4 mg/L）上誘導(dǎo)成愈傷組織.將生長在固體培養(yǎng)基的愈傷組織，在無菌條件下接種到未添加瓊脂的液體培養(yǎng)基內(nèi)（MS+2，4-D 0.4 mg/L）進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，接種量為100 g/L（即每50 mL培養(yǎng)基中接種筋骨草細(xì)胞鮮重5 g），pH調(diào)至6.0.每隔7 d進(jìn)行一次繼代.本實驗使用繼代次數(shù)為4代的懸浮體系.培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照強(qiáng)度2 000 lux，濕度為70%.搖床速度：110～120 r/min.

1.2.2 篩選ABA濃度閾值 本實驗設(shè)定0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L共5個ABA質(zhì)量濃度梯度，并以空白為對照.加入到接種量為100 g/L已培養(yǎng)7 d的懸浮體系中.觀察匍枝筋骨草在不同懸浮體系中生長狀態(tài)和生物量，根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，選出最適合的ABA添加濃度.

1.2.3 防御酶的提取及活性測定

（1）SOD提取與活性測定 采用南京建成生物公司提供的總SOD測試盒進(jìn)行提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0～7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500～4 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定.以每1 g組織在1 mL反應(yīng)液SOD抑制率達(dá)到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位.

（2）CAT提取與活性測定 采用總CAT測試盒（南京建成生物公司）提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL生理鹽水，制成100 g/L的勻漿液，2 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定.以每1 mg組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位.

（3）POD提取與活性測定 采用總POD測試盒（南京建成生物公司）提取，稱取植物組織1 g，加入9 mL 0.1 mol/L pH 7.0～7.4的磷酸緩沖液，制成100 g/L的勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測定.以每1 mg組織蛋白每分鐘分解1 μg底物的酶量為一個活力單位.

（4）PAL提取與活性測定 參照李靖[9]等的方法測定.取1 g（鮮質(zhì)量）懸浮細(xì)胞，加入少量 PVP和石英砂，4 ℃下研磨，加入5 mL預(yù)冷的酶提取液（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 pH 6.0，含2 mmol/L EDTA，4 mmol/L DTT）勻漿，混勻后10 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清為胞內(nèi)酶待測液.1 mL酶待測液（同時以1 mL蒸餾水為對照），加入2 mL 0.01 mol/L且pH 8.8 的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，混勻，37 ℃保溫30 min后，加入0.2 mL鹽酸終止反應(yīng).測定290 nm處的吸光值.以每分鐘吸光值增加 0.01所需酶量為1個酶活性單位（U）.