付瑜華 蒙秋伊 李秀詩(shī) 楊小雨 敖茂宏 周祥 申剛 劉凡值

摘要：【目的】掌握薏苡二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因（ClDGAT）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)油酸脫飽和酶基因（ClFAD2）和硬脂酸脫飽和酶基因（ClSAD）的生物信息學(xué)特性，明確薏苡油脂代謝調(diào)控機(jī)制，為今后開(kāi)展以提高薏苡含油量和改良脂肪酸組成為目標(biāo)的育種研究提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷肦T-PCR和RACE克隆薏苡油脂合成關(guān)鍵基因（ClDGAT、ClFAD2和ClSAD），通過(guò)染色體步移技術(shù)獲得ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列，并以ExPASy ProtParam tool、SMART、TMHMM Server v.2.0和SOPMA等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】從薏苡葉片中成功克隆獲得ClDGAT、ClFAD2和ClSAD基因，NCBI登錄號(hào)分別為MK589802、MK589803和MK589804。其中，ClDGAT基因cDNA序列全長(zhǎng)1842 bp，其開(kāi)放閱讀框 （ORF）為1539 bp，編碼512個(gè)氨基酸;ClFAD2基因cDNA序列全長(zhǎng)1768 bp，其ORF為1164 bp，編碼387個(gè)氨基酸，無(wú)內(nèi)含子;ClSAD基因cDNA序列全長(zhǎng)1727 bp，其ORF為1182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，有2個(gè)內(nèi)含子。ClDGAT和ClFAD2為不穩(wěn)定蛋白，ClSAD為穩(wěn)定蛋白;ClDGAT為疏水性蛋白，ClFAD2和ClSAD為親水性蛋白。ClDGAT蛋白含有MBOAT功能域，有9個(gè)跨膜區(qū);ClFAD2蛋白含有2個(gè)功能域（DUF3473和FA_desaturase），有3個(gè)跨膜區(qū);ClSAD蛋白含有FA_desaturase_2功能域，無(wú)跨膜區(qū)?；诘鞍装被嵝蛄邢嗨菩詷?gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，ClDGAT、ClFAD2和ClSAD均與高粱對(duì)應(yīng)的蛋白聚類在同一分支上，即薏苡在進(jìn)化關(guān)系上與高粱的親緣關(guān)系最近。ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列上均含有光響應(yīng)元件（Light responsive element）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（Auxin-responsive element）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJA-responsive element）和ABA響應(yīng)元件（ABA responsive element）?！窘Y(jié)論】ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列上含有抗逆性相關(guān)順式作用元件和植物激素響應(yīng)元件，說(shuō)明ClFAD2和ClSAD基因不僅參與薏苡的籽粒發(fā)育及油脂合成，還可能與植株的抗逆響應(yīng)相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 薏苡;ClDGAT基因;ClFAD2基因;ClSAD基因;油脂合成;順式作用元件

0 引言

【研究意義】薏苡（Coix lacryma-jobi）具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健及藥用價(jià)值，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用作物（Hsia et al.，2006;楊紅亞等，2007;李秀詩(shī)等，2019）。薏苡仁油和薏苡糠油具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用（覃玉桃等，2001;Lee et al.，2008;Chen et al.，2012），尤其以薏苡仁油作為主要成分研制出的康萊特注射液已廣泛用于肺癌、肝癌和鼻癌等疾病治療（李毓和胡笑克，2005;Fu et al.，2014;Liu et al.，2014;Qi et al.，2015）。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）將薏苡仁甘油三油酸酯含量作為薏苡仁藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，即薏苡仁油脂含量是薏苡仁藥用和保健功效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。因此，開(kāi)展薏苡油脂合成關(guān)鍵酶基因克隆及其生物信息學(xué)分析，不僅有利于揭示薏苡油脂合成代謝調(diào)控機(jī)理，還能為其分子遺傳育種研究提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物籽粒油脂合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括脂肪酸合成、脂肪酸合成后修飾及甘油三酯組裝。在擬南芥中，目前已發(fā)現(xiàn)600多個(gè)參與油脂代謝的相關(guān)基因，涉及120個(gè)酶促反應(yīng)（Beisson et al.，2003;Li-Beisson et al.，2010）。多種植物突變體及基因工程研究均表明，硬脂酸脫飽和酶（Stearoyl-ACP desaturase，SAD）（Luo et al.，2006，2009）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)油酸脫飽和酶（Fatty acid desaturation 2，F(xiàn)AD2）（Patel et al.，2004）、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）（Jako et al.，2001）分別是油酸、亞油酸和甘油三酯合成的關(guān)鍵酶，直接影響植物組織中不飽和脂肪酸油酸及亞油酸和甘油三酯的含量。Taylor等（2009）研究表明，在油菜中過(guò)表達(dá)DGAT1基因，其種子油脂含量增加14%;Li-Beisson等（2010）研究表明，在白菜型油菜中反義表達(dá)甘藍(lán)型油菜SAD基因，其轉(zhuǎn)基因白菜型油菜種子中的硬脂酸含量增加40%;Du等（2016）研究證實(shí)，在擬南芥和玉米種子中特異過(guò)表達(dá)ZmSAD1基因后，其種子中的硬脂酸含量較正常植株明顯降低;Shi等（2017）、Yang等（2018）利用RNAi技術(shù)分別抑制油菜和大豆的FAD2基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜和大豆種子中的油酸含量明顯提高;Zheng等（2017）將AhDGAT1基因轉(zhuǎn)入煙草后，其轉(zhuǎn)基因煙草種子油脂含量提高14.7%～20.9%;Chellamuthu等（2019）在缺失TAG合成基因的酵母突變體中表達(dá)芝麻DGAT1基因，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因酵母表現(xiàn)出較高的油含量;Zheng等（2019）在擬南芥種子中特異表達(dá)椰子DGAT2基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子亞油酸含量顯著增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】薏苡籽粒油脂含量在不同材料中存在明顯差異（Liu et al.，2015;楊陽(yáng)等，2017），但導(dǎo)致其差異的遺傳基礎(chǔ)至今尚未明確，有關(guān)薏苡籽粒油脂合成及代謝的調(diào)控機(jī)制研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用RT-PCR和RACE克隆薏苡油脂合成關(guān)鍵基因（ClSAD、ClFAD2和ClDGAT），通過(guò)染色體步移技術(shù)獲得ClSAD和ClFAD2基因的啟動(dòng)子，并對(duì)獲得的所有序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在明確薏苡油脂代謝調(diào)控機(jī)制，為今后開(kāi)展以提高薏苡含油量和改良脂肪酸組成為目標(biāo)的育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為貴州薏苡主栽品種興仁小白殼。興仁小白殼種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所資源圃內(nèi)，于薏苡生長(zhǎng)至3～4葉期時(shí)采集葉片， -20 ℃保存?zhèn)溆谩RIzol試劑和5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Version 2.0）購(gòu)自Invitrogen公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis購(gòu)自Fermentas公司，Ex Taq DNA聚合酶和Genome Walking Kit購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，SMARTerTM RACE 3' Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。主要儀器設(shè)備：T100梯度PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)），DYY-6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀（北京六一生物科技有限公司），DYCP-32B型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Gel DocTM XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）。

1. 2 DNA提取及cDNA合成

采用CTAB法提取薏苡葉片DNA;使用TRIzol試劑提取薏苡葉片RNA，然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。獲得的薏苡DNA和cDNA均采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 油脂合成關(guān)鍵基因cDNA序列克隆

根據(jù)NCBI上已公布的擬南芥、水稻、高粱、玉米、二穗短柄草和大豆等的SAD、FAD2和DGAT基因序列，采用ClustalX分別對(duì)3個(gè)基因的中間片段進(jìn)行簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以cDNA為模板，中間片段的PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Ex Taq Buffer 25.0 μL，dNTP Mix（10 mmol/L）1.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，上、下游引物（10×）各1.5 μL，ddH2O 15.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收目的片段并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

根據(jù)3個(gè)基因的中間片段序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)各基因的5'-RACE引物（3條）和3'-RACE引物（2條），引物序列見(jiàn)表1。5'-RACE擴(kuò)增和3'-RACE擴(kuò)增分別根據(jù)5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Version 2.0）和SMAR-TerTM RACE 3' Kit說(shuō)明進(jìn)行操作，擴(kuò)增片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收目的片段并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1. 4 ClFAD2和ClSAD基因組序列及其啟動(dòng)子擴(kuò)增

根據(jù)已擴(kuò)增獲得的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增ClFAD2和ClSAD基因組序列的特異引物（表1）。以DNA為模板，PCR反應(yīng)體系同1.3，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s（ClFAD2基因）或3 min（ClSAD基因），進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序鑒定。此外，根據(jù)ClFAD2和ClSAD基因組序列，采用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物（表1）沿啟動(dòng)子方向擴(kuò)增2次，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增的引物分別命名為SP1-1/SP2-1和SP1-2/SP2-2。啟動(dòng)子擴(kuò)增按照Genome Walking Kit說(shuō)明進(jìn)行操作，擴(kuò)增片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1. 5 生物信息學(xué)分析

采用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)獲得的3個(gè)基因cDNA序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）分析，并推導(dǎo)其蛋白氨基酸序列;利用Gene Structure Display Server 2.0繪制基因結(jié)構(gòu)圖（Hu et al.，2015）;以ExPASy ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白氨基酸組成及其理化性質(zhì);運(yùn)用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)蛋白功能域;以TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū);分別采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu);以MEGA 7.0構(gòu)建基于DGAT、FAD2和SAD氨基酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);并利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子序列順式作用元件分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ClDGAT、ClFAD2和ClSAD基因克隆及測(cè)序分析結(jié)果

根據(jù)NCBI上已公布的DGAT、FAD2和SAD基因保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從薏苡葉片中克隆獲得ClDGAT基因（圖1-A）、ClFAD2基因（圖1-B）和ClSAD基因（圖1-C）的中間序列分別為1120、832和661 bp。5'-RACE克隆獲得3個(gè)基因的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）序列分別為564、378和448 bp（圖1-D、圖1-E和圖1-F）;3'-RACE克隆獲得3個(gè)基因的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）序列分別為414、795和746 bp（圖1-G、圖1-H和圖1-I）。將獲得的序列進(jìn)行拼接后，得到ClDGAT基因cDNA序列全長(zhǎng)1842 bp，其ORF為1539 bp，NCBI登錄號(hào)MK589802;ClFAD2基因cDNA序列全長(zhǎng)1768 bp，其ORF為1164 bp，NCBI登錄號(hào)MK589803;ClSAD基因cDNA序列全長(zhǎng)1727 bp，其ORF為1182 bp， NCBI登錄號(hào)MK589804。此外，以薏苡葉片DNA為模板，從基因組擴(kuò)增獲得的ClFAD2和ClSAD基因序列分別為1189和4288 bp，與對(duì)應(yīng)的cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)ClFAD2基因無(wú)內(nèi)含子，而ClSAD基因有2個(gè)內(nèi)含子（圖2），其最大內(nèi)含子為1747 bp。

2. 2 ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析結(jié)果（表2）表明，ClDGAT蛋白包含512個(gè)氨基酸，分子量為57656.74 Da，理論等電點(diǎn)（Ip）為9.14;ClFAD2蛋白包含387個(gè)氨基酸，分子量為44226.96 Da，Ip為8.38;ClSAD蛋白包含393個(gè)氨基酸，分子量為44736.03 Da，Ip為6.48。在氨基酸殘基組成方面，ClDGAT和ClSAD蛋白中以亮氨酸含量最高，其次為丙氨酸，而ClFAD2蛋白以丙氨酸含量最高，其次為亮氨酸。此外，ClDGAT和ClFAD2為不穩(wěn)定蛋白，ClSAD為穩(wěn)定蛋白;ClDGAT為疏水性蛋白，ClFAD2和ClSAD為親水性蛋白。

2. 3 ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白功能域及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

使用SMART預(yù)測(cè)ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白功能域，結(jié)果表明，ClDGAT蛋白含有MBOAT功能域，位于第223～501位氨基酸殘基間，MBOAT家族為膜結(jié)合蛋白，具有?；D(zhuǎn)移酶功能，通常含有一個(gè)保守的組氨酸。ClFAD2蛋白含有2個(gè)功能域（DUF3473和FA_desaturase），分別位于第4～73位和第90～355位氨基酸殘基間，且這2個(gè)功能域均為脂肪酸去飽和酶功能域，其中FA_desaturase功能域具有催化在脂肪酸Delta位置加入雙鍵的活性。ClSAD蛋白含有FA_desaturase_2功能域，位于第65～387位氨基酸殘基間，也具有催化在脂肪酸Delta位置加入雙鍵的活性。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，ClDGAT蛋白有9個(gè)跨膜區(qū)，ClFAD2蛋白有3個(gè)跨膜區(qū)，而ClSAD蛋白無(wú)跨膜區(qū)。

ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，3個(gè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有4種結(jié)構(gòu)類型，且以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主（表3）。利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)3個(gè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。ClDGAT蛋白的第369～443位氨基酸殘基能與D-alanyl轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DltB模板比對(duì)上，其QMEAN4為-1.95（圖4-A），GMQE為0.07;ClFAD2蛋白的第89～161位氨基酸殘基能與模板酰基-CoA去飽和酶比對(duì)上，其QMEAN4為-3.83（圖4-B），GMQE為0.08;ClSAD蛋白的第46～393位氨基酸殘基能與模板?；?ACP去飽和酶比對(duì)上，其QMEAN4為-1.24（圖4-C），GMQE為0.82。3個(gè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的QMEAN4均大于-4.00，說(shuō)明采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模的質(zhì)量較好，尤其是ClSAD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的GMQE接近于1.00，即該結(jié)果較可靠。

2. 4 ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果

采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）將ClDGAT、ClFAD2和ClSAD蛋白氨基酸序列分別與已知的13個(gè)植物DGAT蛋白氨基酸序列、14個(gè)植物FAD2蛋白氨基酸序列和11個(gè)植物SAD蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。由圖5～圖7可看出，ClDGAT、ClFAD2和ClSAD均與來(lái)源于高粱的對(duì)應(yīng)蛋白聚類在同一分支上，說(shuō)明薏苡在進(jìn)化關(guān)系上與高粱的親緣關(guān)系最近。DGAT蛋白在植物中存在5種類型（Maraschin et al.，2019），Turchetto-Zolet等（2016）對(duì)其中4種類型（DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT）進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析并基于氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)4種類型能較好地聚為四類。根據(jù)聚類分析結(jié)果可知，本研究克隆獲得的ClDGAT基因應(yīng)為ClDGAT2基因。

2. 5 ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列擴(kuò)增電泳結(jié)果見(jiàn)圖8，每個(gè)基因均沿啟動(dòng)子方向進(jìn)行2次染色體步移，結(jié)果獲得ClFAD2基因ATG上游序列共1900 bp（圖8-A和圖8-B），ClSAD基因ATG上游序列共2337 bp（圖8-C和圖8-D）。采用PlantCARE對(duì)2個(gè)基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示。ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列上均含有光響應(yīng)元件（Light responsive element）、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（Auxin-responsive element）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（MeJA-responsive element）和ABA響應(yīng)元件（ABA responsive element），而ClSAD基因啟動(dòng)子序列上還包括缺氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子元件（Enhancer-like element involved in anoxic specific inducibility）、低溫響應(yīng)元件（Low-temperature responsive element）和干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MYB binding site involved in drought-inducibility）。

3 討論

本研究克隆獲得ClDGAT、ClFAD2和ClSAD基因cDNA全長(zhǎng)序列及ClFAD2、ClSAD基因組和啟動(dòng)子序列，并對(duì)ClDGAT、ClFAD2和ClSAD基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本課題組曾多次嘗試克隆ClDGAT基因組序列，但均未成功，推測(cè)其含有較長(zhǎng)的內(nèi)含子或復(fù)雜結(jié)構(gòu)。高等植物SAD基因存在結(jié)構(gòu)多樣性（趙豐蘭等，2018），蓖麻、亞麻和三葉草的SAD基因有內(nèi)含子，可可、丹參、擬南芥和油茶等植物的SAD基因無(wú)UTR序列，而銀杏、大豆、麻瘋樹(shù)和花生等植物的SAD基因均含有5'-UTR和3'-UTR，因此推測(cè)不同植物的SAD基因表達(dá)調(diào)控模式存在明顯差異。本研究克隆獲得的薏苡SAD基因不僅包含5'-UTR和3'-UTR，還存在2個(gè)內(nèi)含子。Wang和Dooner（2012）根據(jù)bz富基因區(qū)域7個(gè)基因在薏苡、高粱和玉米中的比對(duì)分析，推測(cè)出薏苡與玉米分化于1210萬(wàn)年前，而與高粱分化于930萬(wàn)年前。本研究中基于蛋白氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，ClDGAT、ClFAD2和ClSAD分別與SbDGAT、SbFAD2和SbSAD聚類在同一分支上，與Leseberg和Duvall（2009）、Cai等（2014）的研究結(jié)論一致，說(shuō)明薏苡在進(jìn)化關(guān)系上與高粱的親緣關(guān)系最近。

ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列上均含有與抗逆性相關(guān)及植物激素響應(yīng)的順式作用元件，如光響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件。已有研究表明，茉莉酸甲酯和生長(zhǎng)素均與提高植物在干旱和低溫脅迫下的抗性表現(xiàn)相關(guān)（陳丹等，2016;忽雪琦等，2018;馬曉寒等，2018），說(shuō)明ClFAD2和ClSAD基因的功能可能與植物抗逆響應(yīng)相關(guān)。與ClFAD2基因啟動(dòng)子相比，ClSAD基因啟動(dòng)子含有更多的植物激素響應(yīng)元件及抗逆性相關(guān)響應(yīng)元件，推測(cè)在薏苡遭遇環(huán)境脅迫或體內(nèi)植物激素改變的情況下，ClSAD基因的表達(dá)變化更敏感和迅速。尤其在低溫脅迫下，ClSAD作為脂肪酸去飽和系列反應(yīng)中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，在調(diào)控膜飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例及維持植物細(xì)胞膜呈正常流動(dòng)鑲嵌狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用（趙豐蘭等，2018）。此外，ClSAD基因啟動(dòng)子序列上含有胚乳表達(dá)和分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，說(shuō)明ClSAD基因可能為組織特異表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)，與趙豐蘭等（2018）的研究報(bào)道一致，即大部分已報(bào)道的SAD基因在植物綠色器官和發(fā)育期種子中高表達(dá)，如亞麻SAD基因的表達(dá)量在種子子房中最高（Fofana et al.，2006），油樟SAD基因的表達(dá)量在發(fā)育葉片中最高（Luo et al.，2009），高油玉米中的SAD基因表達(dá)量高于普通玉米（Liu et al.，2009）。

植物種子油脂含量是一個(gè)數(shù)量性狀，由少數(shù)幾個(gè)主效基因（與油分組成性狀相關(guān)）和多個(gè)微效基因調(diào)控（Li et al.，2013），雖然其調(diào)控途徑復(fù)雜，但可通過(guò)遺傳育種和人工選擇進(jìn)行高油材料創(chuàng)制（Moose et al.，2004）;而種子油分組成僅受少數(shù)關(guān)鍵基因調(diào)控（Li et al.，2013）。本研究克隆獲得3個(gè)薏苡油脂合成關(guān)鍵基因及其中2個(gè)基因的啟動(dòng)子序列，為后續(xù)開(kāi)展薏苡油脂含量和成分的遺傳結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)理研究提供了基因資源。

4 結(jié)論

ClFAD2和ClSAD基因啟動(dòng)子序列上含有抗逆性相關(guān)順式作用元件和植物激素響應(yīng)元件，說(shuō)明ClFAD2和ClSAD基因不僅參與薏苡的籽粒發(fā)育及油脂合成，還可能與植株的抗逆響應(yīng)相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）