李輝，楊青青，張恒，徐瓊，朱建，陳濛濛

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?，包括心肌梗塞、心絞痛和冠狀動脈硬化，是世界范圍內(nèi)致殘、致死的主要原因[1,2]。PHACTR1基因位于染色體6p24位點，屬于PHACTR1-4家族，可編碼磷酸酶和肌動蛋白調(diào)節(jié)器-1[3]，而這兩者可通過增加低密度脂蛋白的氧化促進動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[4]。動脈粥樣硬化是冠心病（CHD）發(fā)病的關鍵因素，因此PHACTR1基因可能與CHD發(fā)病相關，故本研究擬探討PHACTR1基因rs2026458、rs9349379位點多態(tài)性與皖北地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生的相關性。

1 資料和方法

1.1 研究對象研究納入2017年12月至2018年12月于蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管科住院的患者93例為CHD組，CHD組入選標準為：經(jīng)冠狀動脈造影術結(jié)果為陽性，且至少1支冠狀動脈直徑狹窄程度≥50%的皖北地區(qū)漢族人，患者彼此間無血緣關系，其中男性64例、女性29例，年齡（62.44±9.19）歲。對照組入選者為：同期在此醫(yī)院經(jīng)心電圖和病史檢查除外冠心病的104例體檢者，其中男性58例，女性46例，年齡（55.63±14.41）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床指標檢測所有研究對象于清晨空腹采血行生化指標的測定。包括檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL），高壓液相色譜法測定糖化血紅蛋白（HbA1c）。根據(jù)研究對象的體質(zhì)量和身高，計算體質(zhì)指數(shù)（BMI）=體質(zhì)量/身高2（kg/m2）。

1.2.2 冠心病診斷以上患者均行冠狀動脈血管造影（CAG）檢查：從股動脈或橈動脈途徑進入，采用Judkin法行選擇性左、右CAG。使用造影劑后，左冠狀動脈至少行5個及5個以上的體位投影，右冠狀動脈至少行2個以上的體位投影，以明確判斷冠狀動脈狹窄程度。冠心病診斷標準：造影示左主干、左前降支、左回旋支或右冠狀動脈至少有1支管腔面積狹窄≥50%。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測取外周靜脈血5 ml，蛋白酶K處理后常規(guī)苯酚氯仿法提取基因組DNA。對PHACTR1基因rs2026458和rs9349379多態(tài)性位點的DNA片斷進行PCR擴增。引物由邁普生物工程（上海）股份有限公司合成，rs2026458正向引物（5’- AGGTCAAGTGCTGGTTGTGATG -3’）、逆向引物（5’- CCTCGTGAGTGGAGAGTTTACC-3’）；r s 9 3 4 9 3 7 9 正向引物（5’-CTGGTTTATTCTGCCCTCC -3’）、逆向引物（5’- GGAATTGTTAGTAGGCTGAAA -3’）。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，割取大小對等的目的條帶，按照天根回收試劑盒（DP214-03）純化回收。Sanger測序?qū)嶒灒簻y序反應體系：總體系5 μl，測序Primer 2 μl（3.2 μM），純化后PCR產(chǎn)物1-3 μl，Big Dye Mix kit 1 μl。反應程序：94℃ 1 min；28 cycles：94℃ 20 s，50℃ 10 s，60℃ 4 min；4℃ 30 min。退火溫度58℃。測序及數(shù)據(jù)分析：使用3730 xl 測序儀進行測序。用DNA Sequencing analysis軟件分析測序結(jié)果，用Sequencing Analysis 5.2.0軟件進行解讀，并Sequencher 5.1軟件包進行比對分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。驗證是否符合Hardy-Weinberg平衡，基因型及基因頻率采用頻率計數(shù)法計算；計量資料用均值士標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，非正態(tài)分布的計量資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗；使用Logistic回歸分析篩選冠心病發(fā)生的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 兩組間一般資料比較CHD組年齡較大，體重、高血壓、2型糖尿病、吸煙史、HbA1c、TG、LDL顯著高于對照組，HDL顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩組在性別、身高、BMI、TC等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組臨床資料和生化指標比較（n，%）

圖1 PHACTR1基因rs2026458多態(tài)性測序結(jié)果

圖2 PHACTR1基因rs9349379多態(tài)性

2.2 基因型比較分析圖1、圖2為基因測序圖。經(jīng)Handy-Weinberg吻合度檢驗，2個位點的基因型分布均符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律（Hardy-Weinberg Equilibrium），表明對象來自于同一群體（P＞0.05）。PHACTR1基因rs2026458位點在皖北地區(qū)漢族人群中存在CC/CT/TT三種基因型。PHACTR1基因rs9349379位點在皖北地區(qū)漢族人群中存在AA/AG/GG三種基因型。兩組間rs2026458位點和rs9349379位點的基因型比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。rs2026458位點C等位基因頻率高，但兩組間比較，差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表2 兩組PHACTR1基因rs2026458和rs9349379基因型頻率比較（n，%）

2.3 rs2026458和rs9349379位點多態(tài)性與CHD患者臨床指標的關系在CHD患者中，rs2026458和rs9349379位點三種不同基因型攜帶者間BMI、HbA1c、TG、HDL、LDL比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。rs2026458位點三種不同基因型攜帶者間TC比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但rs9349379位點三種不同基因型攜帶者間TC比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表4）。

表3 兩組PHACTR1基因rs2026458和rs9349379等位基因頻率比較（n，%）

表4 rs2026458和rs9349379基因型與冠心病患者臨床指標的關系

2.4 Logistic回歸分析以有無CHD為因變量，以年齡、BMI、高血壓、2型糖尿病、吸煙史、HbA1c、TC、LDL、HDL為自變量，經(jīng)Logistic回歸分析，結(jié)果示LDL（OR=3.837，95%CI：1.722～8.548），是CHD發(fā)生的危險因素（P＜0.05）（表5）。

表5 Logistic回歸分析篩選CHD危險因素

3 討論

PHACTR1是蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)因子，參與內(nèi)皮一氧化氮合成的調(diào)控，而一氧化氮具有許多心臟保護功能，如內(nèi)源性血管擴張劑、血小板抑制劑、抗氧化劑、抗凝血劑和抗血栓形成等作用[5]。此外，研究人員還證明，PHACTR1是血管生成的關鍵元素[6]和基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)因子，可通過穩(wěn)定結(jié)締組織參與斑塊穩(wěn)定[7]。繼Kathiresan等首次報道了PHACTR1基因的位點多態(tài)性與冠心病有關后[8]，幾個獨立GWAS研究也證實了這一結(jié)果[9-11]。新近研究提示，動脈斑塊上PHACTR蛋白的表達受導致動脈粥樣硬化的炎性刺激物調(diào)節(jié)[12]。

我國研究曾報道，PHACTR1基因rs2026458位點與頸動脈、主動脈弓鈣化明顯相關，而rs9349379位點與頸動脈、主動脈弓鈣化無明顯相關性[13]。另一項研究顯示，PHACTR1基因rs9349379的位點多態(tài)性與漢族人群冠心病發(fā)病風險下降有關[14]。而國外研究提示，rs2026458和rs9349379多態(tài)性與冠脈病變相關[15]。眾所周知，等位基因頻率的差異和連鎖不平衡結(jié)構(gòu)也可能是種群內(nèi)部遺傳變異的結(jié)果，因此，各種族之間基因的聯(lián)系可能會有所不同。故本研究選取rs2026458和rs9349379兩個位點，進行單核苷酸多態(tài)性檢測。

和既往研究[16]一致的是，我們發(fā)現(xiàn)，研究人群中rs2026458和rs9349379位點存在多態(tài)性，但兩位點的基因分布頻率在兩組間無顯著差異。在CHD患者中，rs9349379位點A/A基因型攜帶者總膽固醇水平高于A/G基因型攜帶者和G/G基因型攜帶者，差異有統(tǒng)計學意義。提示，rs9349379位點多態(tài)性可能與血脂代謝有關。高血脂是冠心病發(fā)病的傳統(tǒng)危險因素，本研究提示，LDL是冠心病發(fā)病的危險因素。LDL在一定條件下受氧化修飾形成ox-LDL[17]。在一項全基因組表觀遺傳學和表達研究中，暴露于ox-LDL環(huán)境的巨噬細胞中PHACTR1呈高表達[4]，ox-LDL可能通過影響動脈血管內(nèi)皮細胞PHACTR1的表達影響血管生成或動脈粥樣硬化[12]。此外，利用免疫組織化學方法，證實了PHACTR1在動脈粥樣硬化病變中的表達增加，富脂巨噬細胞或泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊中PHACTR1最豐富的來源[18]。

一項映射研究表明，rs9349379位點可能是引起冠狀動脈病變的變異區(qū)域[6]，轉(zhuǎn)錄組測序技術發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈、脛骨動脈和主動脈組織中rs9349379單核苷酸多態(tài)性是PHACTR1的表達數(shù)量性狀基因座[19]，但本研究未發(fā)現(xiàn)rs9349379位點與CHD有相關性，這可能與PHACTR1基因位點多態(tài)性存在種族及地域的異質(zhì)性有關。

綜上所述，皖北地區(qū)漢族人群 PHACTR1基因rs2026458和rs9349379位點多態(tài)性可能與冠心病的發(fā)生無關。但本研究存在一定的局限性，只分析了兩個基因位點多態(tài)性，且研究例數(shù)較少，兩組在年齡方面存在差異。此外，還存在生存偏差，即只有存活的患者才會入組，其結(jié)果可作為今后大樣本量研究的基礎。