王 斌,肖 何,張志敏,羅 佳,金 豐,王 閣,馬俊剛

(陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:mjg31403699@sohu.com)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,同時也是美國男性群體中發(fā)病率第一、死亡率第二的惡性腫瘤[1]。前列腺癌雖然不是我國男性群體發(fā)病率第一的惡性腫瘤,但其發(fā)病率和死亡率逐年增加[2]。前列腺癌治療方式主要包括手術(shù)治療和雄激素阻斷治療,但由于前列腺癌起病較隱匿,發(fā)現(xiàn)時多是晚期,因而預(yù)后并不理想[3]。篩選前列腺癌的特異性生物標志物和分子靶向治療位點,對前列腺癌的診斷和診治具有重要臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類由19-25個核苷酸組成的內(nèi)源單鏈RNA分子,是一種高度保守的RNA[4]。miRNA雖然不能編碼蛋白,但可通過特異性結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)3′非翻譯區(qū)(UTR),抑制靶基因mRNA的翻譯或者直接導致其降解,從而下調(diào)靶基因的表達[5]。近年來的研究表明,miRNA在細胞的各種生命活動中發(fā)揮著重要調(diào)控作用,同時參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。在前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種腫瘤中均存在miRNA的異常表達[4]。miRNA通過調(diào)控靶基因的表達,抑制或促進腫瘤細胞的惡性生物學行為[7]。最新的研究表明,miR-5047在宮頸癌組織和細胞系中表達明顯降低,可抑制宮頸癌細胞的遷移、化療敏感性[8]。miR-5047在其他腫瘤如前列腺癌中的表達和生物學功能并不清楚。本研究通過檢測miR-5047在前列腺癌細胞株中的表達,在表達量最少的前列腺癌細胞中采用慢病毒過表達miR-5047,觀察miR-5047對前列腺癌細胞遷移和增殖能力的影響,通過生物學信息學技術(shù)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-5047的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

KSFM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司;前列腺癌細胞株(C4-2B、LNCaP、DU-145、PC-3)和正常前列腺濾泡細胞(RWPE-1)購于上海信然生物技術(shù)有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司;慢病毒Lenti-miR-NC、Lenti-miR-5047、miR-5047模擬物、miR-NC模擬物、3′UTR雙熒光素酶質(zhì)粒(野生型和突變型)購于上海吉瑪生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Thermo Fisher Scientific公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司;一抗MDM2、p-AKT、Tpl2、GAPDH、TIPE3購于美國Abcam公司;二抗(羊抗兔)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和感染

C4-2B、LNCaP、DU-145、PC-3細胞培養(yǎng)在含1 g/L青霉素、1 g/L鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,RWPE-1細胞培養(yǎng)在含1 g/L青霉素、1 g/L鏈霉素、10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基,放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染期1 d前,在6孔板中接種對數(shù)生長期C4-2B細胞,細胞匯合度達到60%時即可慢病毒感染,按照病毒感染復數(shù)(MOI)=20,使用慢病毒Lenti-miR-NC、Lenti-miR-5047感染C4-2B細胞,分別命名為實驗組和對照組。感染后24 h,更換培養(yǎng)基。

1.3 RT-qPCR檢測miR-5047和TIPE3 mRNA的表達量

胰酶消化、離心、收集細胞后,Trizol法提取前列腺癌細胞株(C4-2B、LNCaP、DU-145、PC-3)和正常前列腺濾泡細胞(RWPE-1)總RNA,取500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書,分別檢測miR-5047和TIPE3 mRNA的相對表達量。RT-qPCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán)。以U6作內(nèi)參分析miR-5047的相對表達,以GAPDH作內(nèi)參分析TIPE3 mRNA的相對表達。引物序列見表1。使用2-ΔΔCt方法分析miR-5047和TIPE3 mRNA的相對表達。

表1 RT-qPCR引物序列

Table 1 RT-qPCR primer sequences

基因序列(5′-3′) GAPDH上游:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT下游:GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG U6上游:CTCGCTTCGGCAGCACA下游:AACGCTTCACGAATTTGCGT miR-5047上游:GGGAACGTCGACGCCAACA下游:GTGCAGGGTCCGAGGT TIPE3上游:AAGCACACTGGTTTCCACACT下游:TGGGTCCCTGCATATCCGTT

1.4 細胞劃痕實驗檢測感染C4-2B細胞的遷移能力

在新的6孔板背后劃直線,分別收集感染后的兩組細胞,采用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/孔。用10 μl移液槍槍頭在培養(yǎng)板底部進行劃痕,劃痕路徑與培養(yǎng)板背后的直線垂直。劃線結(jié)束后,使用PBS溶液洗2次,分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下拍照,測量劃痕寬度,遷移率=(0 h寬度-24 h寬度)/24 h寬度×100%。

1.5 MTT法檢測感染C4-2B細胞的增殖能力

采用MTT法檢測兩組細胞于轉(zhuǎn)染后1,2,3,4,5 d的增殖能力。分別調(diào)整感染后的兩組細胞密度,取200 μl/孔接種于96孔板,保證每孔細胞數(shù)量為2 000個,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入20 μl MTT試劑(濃度為5 g/L),孵育4 h后吸去上清,每孔加入130 μl二甲基亞砜,振蕩20 min后,用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A495)值。

1.6 miR-5047與TIPE3 mRNA靶向關(guān)系預(yù)測

基于microRNA.org數(shù)據(jù)庫對miR-5047進行靶基因預(yù)測,篩選并確認TIPE3基因3′UTR存在與miR-5047配對結(jié)合的位點。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

制備對數(shù)生長期C4-2B細胞懸液,接種于新的6孔板。當細胞匯合度達到50%,將3′UTR雙熒光素酶質(zhì)粒(野生型、突變型)與miRNA模擬物(miR-NC、miR-5047)兩兩組合共轉(zhuǎn)染,設(shè)立4個共轉(zhuǎn)染組:野生型+miR-NC組、突變型+miR-NC組、野生型+miR-5047組、突變型+miR-5047組,分別轉(zhuǎn)染至C4-2B細胞,具體操作根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。細胞轉(zhuǎn)染48 h后按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行熒光素酶活性檢測,熒光素梅活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測靶基因的表達

分別收集感染后的兩組細胞,加入含1%苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。蛋白濃度檢測試劑盒檢測每組蛋白濃度,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,在5%脫脂牛奶中封閉1.5 h。分別孵育一抗TIPE3(稀釋比為1 ∶3 000)、MDM2(稀釋比為1 ∶2 000)、p-AKT(稀釋比為1 ∶1 000)、Tpl2(稀釋比為1 ∶1 000)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000),在4 ℃下孵育過夜。TBST溶液洗膜后,孵育二抗(稀釋比為1 ∶10 000)2.5 h。TBST溶液洗膜后,滴加超敏ECL發(fā)光試劑,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌細胞株中miR-5047的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,前列腺癌細胞株(C4-2B、LNCaP、DU-145、PC-3)和正常前列腺濾泡細胞(RWPE-1)中miR-5047的相對表達分別為0.16±0.03,0.55±0.06,0.85±0.04,0.31±0.05和1.00±0.02,前列腺癌細胞株中miR-5047的相對表達明顯低于正常前列腺濾泡細胞(P<0.05,見圖1)。PC-3細胞和C4-2B細胞中miR-5047的表達最低(P<0.01)。與PC-3細胞相比,C4-2B細胞中miR-5047的表達更低(P<0.01),因而選擇C4-2B細胞進行后續(xù)實驗。

與RWPE-1細胞比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 感染后兩組細胞中miR-5047的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,對照組和實驗組C4-2B細胞中miR-5047的相對表達分別為1.00±0.03和8.14±0.52,實驗組miR-5047的相對表達是對照組的19.61%,差異有統(tǒng)計學意義(t=13.60,P<0.01)。

2.3 高表達miR-5047對C4-2B細胞遷移能力的影響

對照組和實驗組細胞遷移率分別為(68.61±5.94)%和(29.36±6.54)%。與對照組比較,實驗組穿膜C4-2B細胞遷移率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=4.36,P<0.01,見圖2),高表達miR-5047可抑制前列腺癌C4-2B細胞的遷移能力。

圖2 高表達miR-5047對C4-2B細胞遷移能力的影響

2.4 高表達miR-5047對C4-2B細胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實驗組C4-2B細胞在感染后第2-5天的A值均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3),表明高表達miR-5047可抑制前列腺癌C4-2B細胞的增殖能力。

與相應(yīng)時點對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.5 miR-5047與TIPE3 mRNA靶向關(guān)系預(yù)測

基于microRNA.org數(shù)據(jù)庫對miR-5047進行靶基因預(yù)測,TIPE3基因3′UTR存在與miR-5047配對結(jié)合的位點,構(gòu)建3′UTR雙熒光素酶質(zhì)粒(TIPE3-WT、TIPE3-MUT),見圖4。

2.6 雙熒光素酶報告基因檢測

雙熒光素酶報告基因檢測顯示,與突變型+miR-5047組比較,野生型+miR-5047組熒光素酶活性降低(P<0.01);與突變型+miR-NC組,野生型+miR-NC組熒光素酶的活性無影響(P>0.05,見圖5),提示miR-5047可靶向結(jié)合TIPE3 mRNA。

圖4 TIPE3基因3′UTR與miR-5047配對結(jié)合位點及TIPE3-MUT突變序列

與突變型+miR-5047組相比,**P<0.01

2.7 高表達對miR-5047對TIPE3 mRNA表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,高表達miR-5047后實驗組C4-2B細胞中TIPE3 mRNA的相對表達明顯低于對照組(0.21±0.04vs1.00±0.06),差異有統(tǒng)計學意義(t=16.96,P<0.01),表明高表達miR-5047可有效下調(diào)TIPE3 mRNA的相對表達。

2.8 TIPE3和AKT信號通路蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果表明,實驗組C4-2B細胞中,TIPE3蛋白表達降低,AKT信號通路蛋白MDM2、p-AKT、Tpl2表達明顯降低(見圖6),提示AKT信號通路轉(zhuǎn)導被干擾。

圖6 高表達miR-5047對TIPE3蛋白和AKT信號通路蛋白表達的影響

3 討論

深入探討前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對前列腺癌的早期診斷和靶向治療具有重要意義[9]。研究表明,miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達,影響細胞的增殖、分化、凋亡、衰老、遷移等各項生命活動[10]。越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中表達異常,其表達水平與患者臨床分期、分級、預(yù)后有關(guān)[11]。Fan等[12]研究表明,miR-301a-3p在人前列腺癌組織和細胞株中表達明顯上調(diào),過表達miR-301a-3p可明顯促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力。Wang等[13]研究表明,miR-488在前列腺癌組織中的表達低于正常前列腺組織,miR-488的過表達可抑制前列腺癌細胞的增殖和糖酵解。目前,國內(nèi)外對miR-5047的報道研究很少,有報道顯示,miR-5047在宮頸癌組織和細胞系中呈低表達,在宮頸癌細胞中發(fā)揮抑癌基因作用[8]。miR-5047對其他腫瘤如前列腺癌細胞生物學行為的影響和作用機制尚不明確。

本研究RT-qPCR檢測顯示,與正常前列腺濾泡細胞相比,miR-5047在前列腺癌細胞株中的表達明顯降低,提示miR-5047可能在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究進一步通過慢病毒感染前列腺癌C4-2B細胞,促進miR-5047的表達。高表達miR-5047后,前列腺癌C4-2B細胞的遷移能力和增殖能力被明顯抑制,進一步表明miR-5047在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究基于microRNA.org數(shù)據(jù)庫對miR-5047進行靶基因預(yù)測,腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣因子3(tumor necrosis factor-α induced protein 8 like 3,TIPE3)基因3'UTR存在與miR-5047配對結(jié)合的位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證明miR-5047可靶向結(jié)合TIPE3基因3'UTR。TIPE3蛋白是一種磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白,屬于TIPE家族分子[14]。TIPE3蛋白包含7個高度保守的α螺旋結(jié)構(gòu),主要由腫瘤壞死因子-α誘導產(chǎn)生[15]。TIPE3在非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、鼻咽癌等多種腫瘤組織和細胞系中高表達,TIPE3可促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,與腫瘤患者的不良預(yù)后和惡性進展有關(guān)[16,17]。RT-qPCR和Western blot顯示,高表達miR-5047后,TIPE3基因在mRNA和蛋白水平的表達降低。有研究顯示,TIPE3蛋白主要通過激活A(yù)KT信號通路,發(fā)揮促進腫瘤惡性進展的作用[18]。本研究通過Western blot發(fā)現(xiàn),TIPE3蛋白表達降低后,p-AKT、MDM2、Tpl2等AKT信號通路蛋白的表達降低,提示AKT信號通路轉(zhuǎn)導被抑制。miR-5047在前列腺癌組織中的表達尚不明確,本研究下一步將通過收集臨床前列腺癌組織,分析miR-5047表達量與前列腺癌臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。

綜上所述,本研究表明miR-5047在前列腺癌細胞株中明顯低表達,miR-5047可負向調(diào)控前列腺癌細胞的遷移和增殖能力,其分子機制是miR-5047通過靶向抑制TIPE3基因的表達,干擾AKT信號通路信號通路的轉(zhuǎn)導。miR-5047可能成為前列腺癌的診斷和治療的候選分子,為前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制研究奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。