鄭 琪,廖子君,馬婕群*,張彥兵,李索妮,李 倩,2,白 杰,2

(1西安交通大學醫(yī)學院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內一科,西安 710061;2西安醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:503557209@qq.com)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,無論是發(fā)病人數還是死亡人數均居所有惡性腫瘤的首位。2015年我國新發(fā)肺癌病例733 300人,死亡人數為610 200人[1]。85%左右的肺癌屬于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),超過40%的肺癌患者初診時就已經發(fā)現肺外轉移,90%的肺癌患者死于遠處轉移。因此,抑制腫瘤的侵襲和轉移是肺癌治療的重要組成部分,一定程度上決定著患者的預后。

HGF/cMET信號通路在胚胎形成、血管生成和傷口愈合等生理過程中發(fā)揮重要作用。NSCLC中HGF/cMET通路的異常激活較為常見,可導致腫瘤侵襲性增加、病情進展和預后不良,還可以造成腫瘤細胞對分子靶向藥物發(fā)生耐藥,因此抑制HGF/cMET是一種有潛力的肺癌治療策略[2,3]。

吉西他濱(GEM)是一種常用的化療藥物,廣泛用于NSCLC的治療,然而吉西他濱抑制NSCLC的作用機制尚不完全清楚。既往研究發(fā)現,NSCLC患者接受吉西他濱化療后,外周血中的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)數量明顯下降,提示吉西他濱對肺癌微轉移具有抑制作用[4]。腫瘤細胞的遷移和侵襲能力是發(fā)生轉移的重要條件,本研究擬探索吉西他濱影響肺癌細胞遷移和侵襲的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人非小細胞肺癌細胞系A549購自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA),細胞凍存于-196 ℃液氮中。

1.2 主要試劑

10%新生小牛血清(美國Invitrogen公司);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Sigma公司);胰蛋白酶(中國寶信生物公司);EDTA(中國北京鼎國公司);DMSO(美國Sigma公司);MTT、RnaseA、碘化丙啶(PI)(美國sigma公司);Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BD Bioscience公司);吉西他濱(法國禮來公司);肝細胞生長因子(HGF,美國Sigma公司);人p-cMET兔單克隆抗體、人cMET兔單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology);辣根過氧化物酶標記的鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的兔IgG抗體(美國Thermo Fisher Scientific,Inc.);其他常規(guī)試劑(分析純)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(中國天津泰斯特公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國FORMA公司);電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);紫外分光光度計(日本島津公司);臺式高速離心機、倒置生物顯微鏡、光學顯微鏡及成像系統(tǒng)(德國Leica公司)、圖像信號采集與分析系統(tǒng)(均購自德國Leica公司);冷凍高速離心機(美國Berkman公司);NanoDrop ND-1000分光光度計(美國NanoDrop公司);FASCalibar流式細胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司);高通量多功能微板測試系統(tǒng)(德國BMG公司);超聲破碎儀VCX500(美國Sonics公司);垂直電泳系統(tǒng)SE260(美國Amersham);水平電泳儀DYCZ-31N、濕法蛋白電轉印系統(tǒng)DYCZ-40D(中國北京六一儀器廠);GBOX-HR全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國SYNGENE公司);6孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning,Lowell,MA)。

1.4 實驗方法

1.4.1 MTT法檢測細胞增殖活力 A549細胞復蘇后接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,取對數生長期的細胞。A549細胞分別加入加入不同濃度的吉西他濱(0,25,50,75 nmol/L)作用24,48,72,96 h,然后檢測OD值;培養(yǎng)結束前4 h,向每孔細胞加入MTT溶液20 μl;棄去培養(yǎng)液,每孔細胞加入150 μl的DMSO,震蕩10 min,使甲瓚結晶充分溶解;POLARstar+OPTIMA多功能熒光酶標儀上檢測OD值(波長490 nm),以只加培養(yǎng)液的3孔為空白對照組,實驗共重復3次。

1.4.2 流式細胞儀檢測細胞周期 根據MTT實驗結果,確定50 nmol/L為吉西他濱的實驗濃度。取對數生長期的A549細胞,接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,分為對照組和實驗組(GEM 50 nmol/L組),每組4孔(n=4)。復蘇凍存的細胞后,顯微鏡下使用細胞計數板計算細胞濃度,加入細胞培養(yǎng)基稀釋調整,使得加樣細胞終濃度為1×105/ml;將50 nmol/L的吉西他濱加入A549細胞,加入培養(yǎng)基的細胞作為對照組,孵育48 h;消化、洗滌并收集細胞;細胞中加入預冷的4 ℃、75%酒精溶液固定細胞;離心沉淀細胞,每孔細胞中加入RNase(10 mg/ml)100 μl,室溫下孵育10 min;每孔細胞加入100 μg/ml的PI染料100 μl,37 ℃、避光條件下孵育30 min,然后開始流式細胞儀檢測;每個樣品取104個細胞,細胞中的PI在488 nm處被氬激光激發(fā),其紅色熒光通過630 nm濾光片收集,結果用B-D FACSort Cell Quest軟件進行DNA分析。

1.4.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 A549細胞復蘇后,接種于6孔細胞培養(yǎng)板,孵育24 h;實驗分為對照組、吉西他濱處理組(50 nmol/L),分別加入細胞培養(yǎng)基和50 nmol/L的吉西他濱,處理24 h后收集細胞;吸取20 ml結合緩沖液,加入60 ml去離子水稀釋(稀釋比例1 ∶4);PBS洗滌細胞兩次,用250 μl結合緩沖液重新懸浮細胞,濃度為1×105/ml;移取100 μl細胞懸液,加入到5 ml流式細胞管中,再向每管中加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和5 μl的PI(20 μg/ml),避光混勻,標記15 min。對照組不加Annexin Ⅴ作校正因子;反應管中加入400 μl PBS緩沖液,流式細胞儀上機檢測,光源為488 nm氬離子激光器,FITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光,PI受激發(fā)后發(fā)出紅色熒光,隨機軟件分析檢測結果。

1.4.4 細胞遷移實驗 Transwell在帶有8 μm炭膜6孔細胞培養(yǎng)板中浸泡1 h;胰酶消化細胞后,使用不含血清的培養(yǎng)基漂洗2次,計數后配成細胞懸液;每孔加入100 μl細胞懸液(0.9×105細胞/孔);下腔室中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為刺激因子,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h;取出Transwell用PBS漂洗2遍,5%戊二醛固定,4 ℃;PBS沖洗2遍,加入0.1%結晶紫染色,室溫下放置30 min;PBS漂洗2遍后用炭刷去除上表面細胞;鏡下觀察、照相并記錄。

1.4.5 細胞侵襲實驗 取300 μl無血清培養(yǎng)基,加入30 μl Matrigel并混勻(冰浴上操作),加入上室各100 μl;放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h;胰酶消化細胞,無血清培養(yǎng)基漂洗3次,計數后配成細胞懸液;用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次;每孔加入100 μl細胞懸液;下腔室中加入600 μl無血清條件培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h;取出Transwell用PBS漂洗2遍,5%戊二醛固定,4 ℃;PBS漂洗2遍后加入0.1%結晶紫染色,室溫下放置30 min;PBS漂洗2遍,用炭刷去除那些未能通過小孔的細胞;侵襲的細胞被固定、染色并計數。

1.4.6 免疫蛋白印跡(Western blot) 收集各組細胞,置入RIPA細胞裂解液中提取細胞總蛋白,分光光度計測定OD260 nm與OD280 nm,根據OD260 nm/OD280 nm值計算蛋白質的濃度。組裝好制膠模具,配制分離膠和堆積膠,用25 μl微量加樣器向凝膠孔中加樣,開始電泳。電泳結束凝膠加入考馬斯亮蘭染色液,37 ℃搖床上搖動染色30 min,37 ℃搖動脫色4 h。將電泳后的凝膠浸泡入轉移緩沖液中,平衡5 min,切除多余部分,進行蛋白轉移。人p-cMET和cMET兔單克隆抗體(1 ∶500稀釋)和β-actin鼠單克隆抗體(1 ∶500稀釋)孵育于培養(yǎng)膜上過夜,隨后使用辣根過氧化物酶標記的兔和鼠的IgG抗體。加入5%脫脂奶粉封閉液室溫下振蕩1-2 h,TBS洗膜3次,每次5 min。將膜放入塑料雜交袋,加入5%BSA/TBS稀釋的一抗,室溫下搖動1 h,4 ℃過夜;棄一抗,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG二抗(1 ∶500稀釋),室溫下搖動2 h;棄二抗,TBS緩沖液洗膜5 min,洗掉膜上的Tween20;按1 ∶1比例將A、B發(fā)光液在暗室內混合,取出NC膜,吸去TBS液;將NC膜放入玻璃皿中,加入已配好的化學發(fā)光底物,置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。應用美國ImageJ軟件分析,計算每個條帶的積分光密度(optic density,OD)值,采用各目的蛋白與內參蛋白條帶的積分光密度比值(targeted protein/β-actin)來表示目的蛋白的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 吉西他濱對A549細胞增殖活力的影響

在細胞培養(yǎng)的4 d內,可以觀察到不同濃度的吉西他濱對細胞增殖活力的抑制效應:25 nmol/L組OD值較0 nmol/L組無明顯變化,其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與0 nmol/L和25 nmol/L相比,50 nmol/L組和75 nmol/L組OD值明顯下降,其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但50 nmol/L組與75 nmol/L組之間OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 吉西他濱對A549肺癌細胞增殖活力的影響 (OD值)

Table 1 Effects of gemcitabine on the cell proliferation ability of A549 cells (OD value)

2.2 吉西他濱對A549細胞周期的影響

流式細胞儀分析了對照組和吉西他濱組(50 nmol/L)細胞周期,結果顯示,與對照組細胞相比,吉西他濱組G1/G0期細胞比例輕度下降(P>0.05),而S期細胞比例明顯上升(P<0.05),G2/M期細胞比例也下降,但其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表2,圖1)。

表2 吉西他濱對肺癌細胞A549細胞周期的影響 (%)

Table 2 Effects of gemcitabine on the cell cycle of A549 lung cancer cells (%)

組別G1/G0SG2/M對照組75.33±4.8119.90±2.464.77±0.71GEM(50nmol/L)60.02±3.0439.37±2.88?6.61±0.13

與對照組相比,*P<0.05

圖1 吉西他濱對A549細胞周期的影響

2.3 吉西他濱對A549細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果表明,吉西他濱作用后A549細胞發(fā)生了明顯的凋亡(見圖2)。

與對照組比較,無論是早期凋亡細胞比例還是晚期凋亡細胞比例均明顯升高(P<0.05,見表3)。

2.4 吉西他濱和HGF對A549細胞遷移和侵襲的影響

腫瘤遷移實驗中,Transwell小室上鋪8 μm的聚碳酸酯膜,上室種植腫瘤細胞,下室加入胎牛血清或某些特定的趨化因子,由于生長需要,腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室運動,進入下室的細胞數量(即顯微鏡下被染色的細胞數量)可反映腫瘤細胞的遷移能力。A549細胞經過吉西他濱(50 nmol/L)處理后,顯微鏡下著色細胞數量明顯減少,代表細胞遷移能力明顯下降;當加入HGF(50 μg/L)后,顯微鏡下著色細胞數量明顯增多,表示細胞的遷移能力明顯升高;當A549細胞被吉西他濱(50 nmol/L)和HGF(50 μg/L)共同處理時,顯微鏡下著色細胞數量的變化提示,細胞遷移能力較單獨吉西他濱處理組升高,低于單獨加入HGF組,與對照組(未加入HGF和吉西他濱)無明顯差異(見圖3,4)。

圖2 吉西他濱對A549細胞凋亡的影響

表3 吉西他濱對肺癌細胞A549凋亡的影響 (%)

Table 3 Effects of gemcitabine on the apoptosis of A549 cells (%)

組別 早期凋亡晚期凋亡對照組2.21±0.781.32±0.25GEM50nmol/L組9.27±3.65?6.63±0.65?

與對照組相比,*P<0.05

圖3 吉西他濱和HGF對A549細胞遷移和侵襲的影響 (×20)

與對照組相比,*P<0.05,與GEM組相比,#P<0.05

2.5 吉西他濱對A549細胞cMET蛋白的影響

A549肺癌細胞被吉西他濱處理后,其p-cMET表達水平明顯下降,當加入HGF時其表達水平明顯升高。與對照組相比,GEM組p-cMET蛋白水平明顯下降(0.451 2±0.110 9vs0.107 6±0.008 2,P<0.05),HGF組p-cMET蛋白水平顯著升高(0.451 2±0.110 9vs0.783 5±0.120 6,P<0.05)。而與對照組相比,吉西他濱組和HGF組的cMET蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05,見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05;與GEM組相比,#P<0.05

上述研究結果提示,吉西他濱可抑制A549肺癌細胞的遷移和侵襲能力,并負向調控HGF/c-MET通路。

3 討論

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)的編碼基因位于第7號染色體q21區(qū),包含18個外顯子和17個內含子,大小約70 kb。蛋白水解酶作用于HGF前體,產生一個由96 kD的α鏈和34 kD的β鏈經二硫鍵連接組成的異二聚體,即為成熟的HGF蛋白。HGF蛋白含6個結構域,分別為氨基末端結構域、4個Kringle結構域及類絲氨酸蛋白酶結構域(SPH),在體內發(fā)揮多種生物學功能,能影響細胞生長,調節(jié)血管生成和免疫活性[5]。尤為重要的是,HGF可促進腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲,HGF高表達是非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)獲得性耐藥的主要原因之一[6]。

間質-上皮轉化因子基因(mesenchymal-epithelial transition factor gene, cMET)屬于原癌基因,位于人類第7號染色體的長臂(7q21-31),翻譯一種受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)。cMET蛋白的胞外區(qū)是配體識別部位,由Sema結構域、PSI結構域和IPT結構域組成,PSI結構域通過4個IPT結構域和跨膜螺旋相連。cMET蛋白是HGF的受體,這種RTK屬于單向I型穿膜異二聚體蛋白,包含由二硫鍵連接的α-chain(50 kD)和β-chain(145 kD)[7]。β鏈穿過細胞膜,且包含細胞漿激酶結構域和結合位點。c-MET蛋白的胞內區(qū)具有酪氨酸激酶催化結構域,有酪氨酸激酶活性,其蛋白受體在多個器官的上皮細胞均有表達,包括肝臟、胰腺、前列腺、腎臟、肌肉和骨髓。HGF由間質細胞分泌,結合于胞外結構域后激活細胞內激酶,可磷酸化位于碳末端結合位點上的酪氨酸。

磷酸化cMET(phospho-cMET或p-cMET)可與生長因子結合受體2(growth factor receptor bound protein 2,Grb2)和Gab1(GRB2-associated-binding protein 1)結合,然后激活下游一系列信號通路,如PI3K/AKT和ERK/MAPK通路[8,9]。研究表明,p-cMET是一個預測腫瘤侵襲性、轉移潛力和不良預后的重要因子[10,11]。近年來的研究不斷證實,HGF/cMET通路在腫瘤細胞增殖、細胞運動、細胞侵襲、血管生成、靶向治療耐藥等方面發(fā)揮重要作用,靶向該通路是一種有潛力的抗腫瘤策略[12-16]。

吉西他濱是一種二氟核苷類抗代謝物抗癌藥,是去氧胞苷的水溶性類似物,是核糖核苷酸還原酶的一種抑制性酶的替代物,這種酶在DNA合成和修復過程中及對脫氧核苷酸的生成是至關重要的。目前,吉西他濱廣泛用于多種惡性腫瘤的治療,如NSCLC、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、軟組織肉瘤、淋巴瘤等。然而,吉西他濱對NSCLC侵襲和轉移的作用機制尚不完全清楚。

此前的研究中發(fā)現,吉西他濱對非小細胞肺癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)有明顯的抑制作用[4]。A549肺癌細胞高表達EpCAM,同時CD45表達陰性,符合CTCs的免疫表型特征,所以在體外研究中可用來代表CTCs[4]。細胞增殖的體外實驗中發(fā)現,吉西他濱對A549細胞增殖活力具有明確的抑制作用。當不同濃度的吉西他濱作用于A549肺癌細胞時,細胞生長曲線顯示,25 nmol/L吉西他濱作用后,A549細胞生長無明顯抑制;50 nmol/L吉西他濱作用后,細胞生長出現明顯抑制;75 nmol/L吉西他濱作用后,細胞生長受到明顯抑制,但50 nmol/L組和75 nmol/L組細胞相比,兩者的細胞增殖活力無明顯差異。由此可見,50 nmol/L和75 nmol/L的吉西他濱對A549細胞增殖活力有近似的抑制作用,因此在以下的實驗中吉西他濱的用量均采用50 nmol/L。

吉西他濱屬于細胞周期特異性藥物,主要作用于S期。多項體外研究發(fā)現,吉西他濱作用于腫瘤細胞后,可使S期細胞比例升高。本研究中,流式細胞術檢測發(fā)現,50 nmol/L的吉西他濱作用于A549細胞后,G1/G0期比例輕度下降,而S期細胞比例明顯上升,G2/M期細胞比例輕度下降,即細胞周期在S期發(fā)生阻滯,這可以解釋吉西他濱引起細胞增殖活力的下降。本研究還發(fā)現,50 nmol/L的吉西他濱可引起A549細胞發(fā)生凋亡,無論是早期凋亡細胞還是晚期凋亡細胞均明顯增加。上述研究結果符合既往研究中吉西他濱的作用。

吉西他濱對A549細胞的增殖活力、細胞周期和凋亡具有明顯的影響,對細胞遷移和侵襲是否也具有調節(jié)作用?本研究發(fā)現,吉西他濱(50 nmol/L)處理后,A549細胞的遷移力和侵襲力受到了明顯抑制,當A549細胞僅加入HGF(50 μg/L)時,其遷移力和侵襲力明顯增強,當被吉西他濱(50 nmol/L)和HGF(50 μg/L)共同處理時,遷移和侵襲細胞的計數較單純吉西他濱處理組高,但低于單獨加入HGF組的細胞。由此可見,吉西他濱不但抑制了A549細胞的遷移和侵襲能力,而且可逆轉HGF誘導的細胞侵襲和遷移能力的上調。

既往的研究發(fā)現,HGF/cMET通路可直接影響腫瘤細胞的遷移和侵襲[17-19]。而吉西他濱既然能夠抑制A549細胞的遷移和侵襲,可能對HGF/cMET通路也具有調控作用,本研究證實了這種推測。研究發(fā)現,吉西他濱(50 nmol/L)作用于NSCLC細胞系A549細胞后,p-cMET蛋白表達水平明顯下降,如果僅加入HGF(50 μg/L)而不加吉西他濱時,p-cMET蛋白表達水平顯著上升,而同時加入HGF和吉西他濱時,p-cMET蛋白表達水平明顯低于單獨加入HGF時。由此可見,吉西他濱對NSCLC的HGF/cMET通路有負向調節(jié)作用。另一項研究中,NSCLC患者接受吉西他濱治療后,外周血CTCs數量下降,伴有HGF和p-cMET的水平明顯下降[4]。上述研究提示,吉西他濱可通過靶向HGF/cMET通路來調節(jié)NSCLC腫瘤細胞的侵襲和微轉移。有關吉西他濱調控HGF/c-MET通路的具體機制目前尚不清楚,有待于進一步研究闡明。

綜上所述,吉西他濱對肺癌A549細胞的遷移和侵襲具有明顯的抑制作用,而這種抑制作用可能是通過負調控HGF/cMET通路來實現的。