阿依提拉·熱合麥提江,屈 園,帕力旦·艾孜提,張法煌,朱世茂,胡慧玲,李 卉

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,烏魯木齊 830011;2新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:huihui922@126.com)

食管癌是近年來常見的惡性消化道腫瘤之一,報(bào)道顯示全球食管癌發(fā)病率和死亡率分別位列第8位和第6位[1]。雖然目前食管癌的診斷和治療手段已有很大的改進(jìn),但多數(shù)食管癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期,錯(cuò)過了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī),5年生存率低于15%[2]。

腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞,這是因?yàn)榇x方式的不同而引起的。腫瘤細(xì)胞里將近50%的ATP是通過糖酵解途徑合成的,這種即使在氧氣充足下,惡性腫瘤細(xì)胞依然通過糖酵解獲取能量并產(chǎn)生乳酸的效應(yīng)方式稱為Warburg效應(yīng)[3]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),丙酮酸脫氫酶(PKM2)是糖酵解途徑中重要的限速酶,PKM2在增殖的細(xì)胞,尤其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),且在Warburg效應(yīng)和腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4,5]。

micro-RNA是一類微小的內(nèi)源表達(dá)的單鏈非編碼RNA[6],其長(zhǎng)度在18-24個(gè)核苷酸左右,它通過與靶基因3′-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì),轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等多個(gè)過程。近年來研究表明[7],mi-RNA在食管癌中的異常表達(dá)具有穩(wěn)定性和特異性,可以作為食管癌診斷的分子標(biāo)志物。miR-378定位于人染色體5q32,在2005年被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)[8]。

癌癥越來越被視為一種代謝相關(guān)疾病,腫瘤相關(guān)的能量調(diào)節(jié)已經(jīng)作為腫瘤治療的生化途徑和藥物靶點(diǎn)。在過去的幾年里,分子和細(xì)胞研究明確地強(qiáng)調(diào)了癌基因和腫瘤抑制因子與癌癥糖酵解的關(guān)系,而且研究[9]表明mi-RNA在介導(dǎo)這種代謝轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過研究miR-378a-3p與PKM2基因的關(guān)系及其對(duì)Eca-109細(xì)胞的作用,驗(yàn)證miR-378a-3p調(diào)控關(guān)系,探索miR-378a-3p是否能成為未來食管癌臨床治療的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RMPI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Hyclone公司)、胰酶細(xì)胞消化液(美國(guó)Gibco公司)、Opti-MEM(美國(guó)Gibco公司)、SanPerp柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(美國(guó)Thermo公司)、BSA蛋白檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo公司)、Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)、兔抗人PKM2抗體(美國(guó)Abcam公司)、ATP檢測(cè)試劑盒(中國(guó)索萊寶公司)、Western blot顯色試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將食管癌細(xì)胞株Eca-109接種于含10%胎牛血清和含青霉素與鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔48 h換液一次,待細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行傳代。將實(shí)驗(yàn)分為4組:①空白對(duì)照組;②陰性對(duì)照組;③miR-378a-3p轉(zhuǎn)染24 h組;④miR-378a-3p轉(zhuǎn)染48 h組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca-109細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染條件:電壓280 V,電阻550 Ω,電容900 CF),之后每孔加2 ml接種于6孔板中。貼壁后換液,在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),24 h及48 h后收取細(xì)胞。

1.2.2 蛋白表達(dá)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h和48 h后的Eca-109細(xì)胞,裂解提取總蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白含量,取等量蛋白質(zhì)以10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,單克隆抗體4 ℃孵育過夜。PBST洗去一抗,二抗室溫孵育2 h。洗滌,ECL試劑盒顯色,凝膠成像系統(tǒng)采集成像。β-actin作為內(nèi)參。成像結(jié)果通過ImageJ灰度分析軟件讀取灰度值,以PKM2/β-actin進(jìn)行分析對(duì)比。

1.2.3 ATP含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 先收集細(xì)胞到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)胞數(shù)量提取液體積(ml)為1 ∶500-1 ∶1 000的比例,超聲波破碎1 min(冰浴,強(qiáng)度20%或200 W,超聲2 s,停1 s),10 000g4 ℃離心3 min,取上清,置冰上測(cè)。把工作液與標(biāo)準(zhǔn)液充分混勻后,立即測(cè)定340 nm下10 s的吸光值A(chǔ)1,然后將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37 ℃水浴中反應(yīng)3 min,拿出擦拭干凈立即測(cè)定其在190 s時(shí)的吸光值A(chǔ)2。分別計(jì)算ΔA測(cè)定=A2測(cè)定管-A1測(cè)定管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A2標(biāo)準(zhǔn)管-A1標(biāo)準(zhǔn)管。

ATP含量按如下公式計(jì)算(按細(xì)胞密度計(jì)算):

ATP含量(μmol/106cell)

=ΔA測(cè)定÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn))×V提取÷5

=0.125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

其中,C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)濃度液,0.625 μmol/ml;V提取:加入的提取液體積,1 ml;5:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),5×106個(gè)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后24 h和48 h各組Eca-109細(xì)胞,消化和PBS洗滌后,加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,經(jīng)膜聯(lián)蛋白-Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)避光孵育15 min后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。其中,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-378a-3p對(duì)PKM2蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組PKM2相對(duì)蛋白水平無顯著差異。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后24 h及miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后48 h PKM2蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1),且miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后48 h較miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后24 h組下降趨勢(shì)更明顯。

2.2 miR-378a-3p表達(dá)對(duì)能量代謝的影響

與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組ATP產(chǎn)量略有增高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后24 h及miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后48 h組ATP含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖2)。

2.3 miR-378a-3p表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后24 h和48 h組細(xì)胞凋亡率分別為4.05%±0.888 8%,4.63%±0.434 9%,15.65%±1.377 2%和17.10%±3.472 8%。由此可以看出:空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率無明顯變化;與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比,miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后24 h及miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞凋亡率顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖3)。

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,*P<0.05

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,**P<0.01

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤之一。它依病理分型,主要分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)兩大類[10]。全球范圍內(nèi)的食管癌約90%是食管鱗癌,我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一,目前,食管癌總的5年生存率僅為15%-25%,每年有超過15萬人死于食管癌[11]。因此,早期診斷及有效治療食管癌極其重要。

與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,***P<0.001

食管癌發(fā)病原因尚不十分清楚,越來越多研究證明食管癌發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多階段共同作用的結(jié)果,是一個(gè)因許多致癌基因、抑癌基因結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生異常不斷累積與協(xié)同作用的過程。因此,通過尋找新的生物標(biāo)記物,提高早期診斷的精準(zhǔn)率,揭示及干預(yù)疾病分子調(diào)控機(jī)制,是降低食管癌死亡率的有效途徑[12]。

腫瘤細(xì)胞最顯著的特征為代謝異常,其能量代謝與正常細(xì)胞有很大不同。研究顯示,這是腫瘤細(xì)胞快速增殖并轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[13]。Warburg效應(yīng)是一種低效能量產(chǎn)生方式。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)與ADP反應(yīng)生成丙酮酸和ATP,是糖酵解的關(guān)鍵酶之一。研究表明[14],M2型丙酮酸激酶(M2 type of pyruvate kinase,PKM2)作為PK的亞型之一,在腫瘤的形成發(fā)展中起著重要的作用。PKM2作為多個(gè)mi-RNA下游共同的靶基因,通過不同的途徑作用于腫瘤細(xì)胞,最終促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。Tang等[15]研究發(fā)現(xiàn)PKM2在多種惡性腫瘤中表達(dá)升高,且與腫瘤耐藥性及預(yù)后相關(guān),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

目前,miR-378的抗腫瘤作用受到廣泛的關(guān)注。微小RNA(mi-RNA)是一類可調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,不僅與多種腫瘤疾病的診斷、預(yù)后和治療密切相關(guān),還可以作為致癌或抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為[16]。研究顯示,miR-378在一些惡性腫瘤中如胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌中表達(dá)下調(diào),有著抑癌基因的作用;但同時(shí)miR-378在諸如白血病、腎母細(xì)胞瘤、肺癌以及胰腺腫瘤中表達(dá)卻是上調(diào)的,這些研究表明了miR-378在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用,且作用機(jī)制較為復(fù)雜[17]。miR-378包括miR-378a-3p和miR-378a-5p。有研究表明,miR-378a-3p可以通過靶向GOLT1A增強(qiáng)他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞反應(yīng)能力。此外,miR-378a-3p是結(jié)直腸癌的預(yù)后影響因素。王曉龍等[18]發(fā)現(xiàn),食管癌細(xì)胞中miR-378a-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常細(xì)胞。大量研究發(fā)現(xiàn),調(diào)控miRNA-155的表達(dá)可影響細(xì)胞的增殖及凋亡等生物學(xué)活動(dòng)[19,20]。然而,關(guān)于miR-378a-3p在食管癌進(jìn)展的生物學(xué)作用和潛在的分子機(jī)制尚不清楚。因此,尋找新的食管癌診斷及治療靶點(diǎn),從而提高食管癌的早診早治非常重要[21]。

為了探討miR-378a-3p與PKM2基因的關(guān)系,以及對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109凋亡及能量代謝的影響,本實(shí)驗(yàn)將miR-378a-3p轉(zhuǎn)染入Eca-109細(xì)胞24 h和48 h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-378a-3p對(duì)Eca-109細(xì)胞凋亡的影響,研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-378a-3p組能夠顯著地增加Eca-109的凋亡。用紫外分光光度法檢測(cè)ATP含量可見轉(zhuǎn)染miR-378a-3p后ATP產(chǎn)量較對(duì)照組明顯降低,Western blotting檢測(cè)miR-378a-3p干預(yù)后PKM2蛋白水平的變化,研究結(jié)果顯示,miR-378a-3p轉(zhuǎn)染后PKM2表達(dá)降低。綜合上述結(jié)果提示:作為有氧酵解途徑中的關(guān)鍵酶PKM2,miR-378a-3p通過抑制其表達(dá),從而干擾腫瘤細(xì)胞的能量代謝,進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究為食管癌的靶向治療及進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù),對(duì)miR-378a-3p功能及作用機(jī)制的研究,有助于探尋新的食管癌候選診斷,治療靶點(diǎn),并揭示食管癌進(jìn)展過程中的生物學(xué)機(jī)制。