李 改,初大可

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:chudake@xjtu.edu.cn)

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,發(fā)病率、死亡率極高,全球每年平均死于結(jié)腸癌的患者達(dá)60.8萬(wàn),發(fā)病率在男性、女性患者中分別居第三、二位[1,2]。近年來,我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)生率快速升高,嚴(yán)重威脅人民生命健康[3,4]。目前臨床上通過手術(shù)、化療、放療、生物治療等方法治療結(jié)腸癌,但效果及預(yù)后不盡如人意,患者5年生存率僅42.7%[5]。因此,尋找更安全高效的抗腫瘤藥物仍然是結(jié)腸癌治療的研究重點(diǎn)[6]。舒尼替尼是一種小分子多靶向酪氨酸激酶抑制劑,是一種多靶點(diǎn)的生物靶向抗腫瘤藥物,對(duì)治療胃癌等腫瘤療效顯著[7]。舒尼替尼在治療中對(duì)腫瘤分子信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制仍有待于深入研究。Notch信號(hào)通路是細(xì)胞間傳導(dǎo)信號(hào)的保守通路,是決定細(xì)胞命運(yùn)、組織發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)通路之一[8]。近來研究發(fā)現(xiàn),Notch信號(hào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[9,10]。而Notch信號(hào)通路是否在舒尼替尼治療結(jié)腸癌中發(fā)揮作用仍需研究證實(shí)。因此,本研究將探究舒尼替尼對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中Notch信號(hào)通路分子及細(xì)胞凋亡的影響,以期為舒尼替尼治療結(jié)腸癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、化學(xué)發(fā)光試劑盒,購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司;胎牛血清、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、GAPDH抗體、Notch1抗體、N-myc下游調(diào)節(jié)基因4(N-myc downstream regulated gene 4,NDRG4)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG,均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司;舒尼替尼(12.5 mg×28粒/盒,國(guó)藥準(zhǔn)字:H20090030)購(gòu)自輝瑞公司;青霉素、鏈霉素、Notch4抗體、P53抗體,均購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司;CCK-8試劑、Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合達(dá)到70%-80%,用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期SW480細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml、100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板,實(shí)驗(yàn)分組為:對(duì)照組,0.75 μmol/L舒尼替尼組,1.5 μmol/L舒尼替尼組,3.0 μmol/L舒尼替尼組,6.0 μmol/L舒尼替尼組。

1.3 CCK-8法檢測(cè)各組SW480細(xì)胞增殖

設(shè)置空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基),培養(yǎng)各組SW480細(xì)胞,分別于培養(yǎng)24,48,72 h后向各組培養(yǎng)基中加入CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng):490 nm)檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。計(jì)算各組SW480細(xì)胞在不同濃度舒尼替尼作用下的增殖抑制率,增殖抑制率(%)=(OD對(duì)照組-OD舒尼替尼組)/(OD對(duì)照組-OD空白對(duì)照組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW480細(xì)胞凋亡

按1.2分組培養(yǎng)細(xì)胞,48 h后收集各組SW480細(xì)胞,用胰蛋白酶消化、PBS洗滌,使用400 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至離心管中,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI,避光孵育15 min,于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW480細(xì)胞周期分布

按1.2分組培養(yǎng)細(xì)胞,48 h后收集各組SW480細(xì)胞,胰蛋白酶消化,PBS洗滌,-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定過夜,收集細(xì)胞,PBS洗滌,加500 μl RNase/PI重懸細(xì)胞,避光染色20 min,于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.6 Western blot法檢測(cè)各組SW480細(xì)胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)

按1.2分組培養(yǎng)細(xì)胞,48 h后收集各組SW480細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度并定量,十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移至PDVF膜上,含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,加入一抗(1 ∶500稀釋的Notch1抗體、Notch4抗體、P53抗體、NDRG4抗體、Bax抗體和1 ∶1 000稀釋的GAPDH抗體)4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加入二抗(1 ∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育1 h,TBST洗滌,化學(xué)發(fā)光法顯影,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像,并分析蛋白條帶灰度值,蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SW480細(xì)胞增殖情況

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,各組SW480細(xì)胞分別培養(yǎng)24,48,72 h的OD值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果顯示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,各組SW480細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高;隨著舒尼替尼濃度升高,SW480細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05,見表1)。

2.2 SW480細(xì)胞凋亡情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW480細(xì)胞培養(yǎng)48 h的凋亡率,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05),且隨著舒尼替尼濃度升高,SW480細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05,見圖1、表2)。

表1 SW480細(xì)胞增殖抑制率比較 (n=6,%)

Table 1 Comparison of inhibition rate of SW480 cell proliferation among five groups (n=6,%)

組別 24h48h72h對(duì)照組5.54±1.469.93±3.27e19.05±4.39ef0.75μmol/L舒尼替尼組8.23±2.53a18.98±4.12ae30.23±5.44aef1.50μmol/L舒尼替尼組17.86±3.94ab27.53±5.16abe49.65±6.38abef3.00μmol/L舒尼替尼組24.53±5.06abc44.19±5.97abce60.07±7.12abcef6.00μmol/L舒尼替尼組41.24±5.74abcd54.67±6.64abcde78.74±8.34abcdef F74.67774.69080.291 P<0.001<0.001<0.001

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05;與24 h相比,eP<0.05;與48 h相比,fP<0.05

圖1 舒尼替尼對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

表2 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細(xì)胞凋亡率比較 (n=6)

Table 2 Comparison of apoptosis rates of SW480 cells among five groups (n=6)

組別 細(xì)胞凋亡率(%)對(duì)照組5.03±1.220.75μmol/L舒尼替尼組11.36±2.65a1.50μmol/L舒尼替尼組34.48±5.63ab3.00μmol/L舒尼替尼組52.69±9.85abc6.00μmol/L舒尼替尼組73.82±10.26abcd F101.324 P<0.001

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

2.3 SW480細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW480細(xì)胞培養(yǎng)48 h的凋亡率,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,不同濃度舒尼替尼組G0/G1期SW480細(xì)胞比例均顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW480細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05)。隨著舒尼替尼濃度升高,G0/G1期SW480細(xì)胞比例均顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW480細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05,見圖2,表3)。

2.4 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細(xì)胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白的表達(dá)情況

Western blot法檢測(cè)各組SW480細(xì)胞培養(yǎng)48 h后Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,不同濃度舒尼替尼組SW480細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),Notch4、P53、NDRG4和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。隨著舒尼替尼濃度的升高,SW480細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05,見表4,圖3)。

圖2 舒尼替尼對(duì)SW480細(xì)胞周期的影響

表3 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細(xì)胞周期分布情況比較 (n=6)

Table 3 Comparison of cell cycle distribution of SW480 cell among five groups (n=6)

組別 G0/G1(%)S(%)G2/M(%)對(duì)照組27.68±4.2252.5±4.9322.78±3.490.75μmol/L舒尼替尼組39.86±4.85a43.58±4.67a17.42±3.26a1.50μmol/L舒尼替尼組48.33±5.08ab36.47±4.13ab13.29±3.08ab3.00μmol/L舒尼替尼組55.16±5.22abc29.61±3.68abc9.16±2.67abc6.00μmol/L舒尼替尼組63.23±5.38abcd22.73±3.51abcd5.88±2.14abcd F45.96844.75630.376 P<0.001<0.001<0.001

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

表4 不同濃度舒尼替尼處理后SW480細(xì)胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)比較 (n=6)

Table 4 Comparison of Notch1, Notch4, P53, NDRG4, Bax protein expression in SW480 cells among five groups (n=6)

組別 Notch1/GAPDHNotch4/GAPDHP53/GAPDHNDRG4/GAPDHBax/GAPDH對(duì)照組0.76±0.120.14±0.050.16±0.060.11±0.030.21±0.040.75μmol/L舒尼替尼組0.58±0.11a0.23±0.07a0.29±0.07a0.24±0.05a0.28±0.06a1.50μmol/L舒尼替尼組0.44±0.10ab0.45±0.09ab0.42±0.08ab0.32±0.06ab0.39±0.09ab3.00μmol/L舒尼替尼組0.32±0.08abc0.58±0.10abc0.56±0.08abc0.52±0.11abc0.56±0.14abc6.00μmol/L舒尼替尼組0.21±0.06abcd0.73±0.12abcd0.69±0.11abcd0.75±0.15abcd0.85±0.19abcd F30.14244.53439.72845.48328.465 P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

與對(duì)照組相比,aP<0.05;與0.75 μmol/L組相比,bP<0.05;與1.50 μmol/L組相比,cP<0.05;與3.00 μmol/L組相比,dP<0.05

圖3 舒尼替尼對(duì)SW480細(xì)胞中Notch1、Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

結(jié)腸癌是世界三大常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類生命健康[11]。舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)的生物靶向抗腫瘤藥物,通過抑制多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用[12]。研究證實(shí),舒尼替尼在腎癌、肺癌化療中的療效及安全性值得肯定,但對(duì)于結(jié)腸癌的作用尚鮮有報(bào)道[13,14]。季流等[15]研究表明,舒尼替尼聯(lián)合FOLFOX4治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的療效和安全性值得肯定,但其作用機(jī)制尚未完全明確。本研究結(jié)果顯示,舒尼替尼組SW480細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均顯著升高,且隨著舒尼替尼濃度升高,同一時(shí)間點(diǎn)SW480細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高,提示舒尼替尼具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。

細(xì)胞增殖、凋亡過程與細(xì)胞周期失調(diào)密切相關(guān),當(dāng)細(xì)胞周期不受機(jī)體正常控制,并不斷進(jìn)入新的循環(huán)時(shí),會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖,這是導(dǎo)致癌細(xì)胞過度增殖的主要原因;當(dāng)細(xì)胞被阻滯于某一周期時(shí),可阻止細(xì)胞進(jìn)入新一輪的細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示,隨著舒尼替尼的處理濃度升高,SW480細(xì)胞G0/G1期比例均顯著升高,S期、G2/M期比例均顯著降低,提示舒尼替尼可能是一種細(xì)胞周期特異性藥物,能夠誘導(dǎo)SW480細(xì)胞阻滯于G0/G1期,并阻止細(xì)胞進(jìn)入S期,從而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

Notch信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要通路,其直接參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展[17]。既往研究表明,Notch信號(hào)在多種腫瘤的增殖調(diào)控中發(fā)揮著重要而多樣的作用,可能存在潛在的調(diào)控機(jī)制[18-20]。梁璐等[1]和劉少瓊等[6]研究表明,黃芩苷、姜黃素均通過抑制Notch1信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡。Zhang等[18]研究表明,過度表達(dá)Notch4可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。李淑靜等[12]研究表明,舒尼替尼通過抑制Notch1表達(dá)誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞凋亡過程。Notch信號(hào)可通過非經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控多個(gè)下游分子,包括NDRG4、P53和Bax等。NDRG4是新型的腫瘤抑制因子,對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡具有調(diào)控作用,是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者總體生存率的指標(biāo)[21]。p53基因是目前基因研究中最深入、最廣泛的腫瘤基因,是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子之一[22]。Bax是B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)家族的促凋亡成員,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示,隨著舒尼替尼處理濃度升高,SW480細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平顯著降低,Notch4、P53、NDRG4、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高,提示舒尼替尼可能通過抑制Notch1蛋白表達(dá),促進(jìn)Notch4、P53、NDRG4、Bax表達(dá),發(fā)揮抑制SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用,但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,舒尼替尼可能通過抑制Notch1蛋白表達(dá)、促進(jìn)Notch4蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)控下游分子信號(hào)通路,誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡。