陳興勝， 何明亮， 劉安民

腦膠質(zhì)瘤是原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，發(fā)病超過顱腦腫瘤的一半［1］。目前針對腦膠質(zhì)瘤的治療方法以手術治療為主，并輔以放療和化療。然而手術并不能將腫瘤完全切除，放化療對預后的改善也不明顯，腫瘤復發(fā)率高。因此，腦膠質(zhì)瘤的治療手段，還需從更多角度進行探究，如靶向治療和免疫治療等。

DCs是一種很重要的抗原提呈細胞，在纖維肉瘤［2］、黑色素瘤［3］等多種腫瘤中能識別腫瘤抗原，并引發(fā)T淋巴細胞等多種免疫細胞產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應。然而，在乳腺癌［4］、肺癌［5，6］、胰腺癌［7］等許多腫瘤中，腫瘤細胞反過來也能影響樹突狀細胞的免疫表型或功能，以規(guī)避來自免疫系統(tǒng)的攻擊，使機體表現(xiàn)出腫瘤免疫抑制的狀態(tài)。同時，有文獻報道，在肝癌［8］、乳腺癌［9］等腫瘤中，對腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細胞進行干預，可一定程度地刺激抗腫瘤效應，抑制腫瘤生長。

凝血酶敏感蛋白1（Thrombospondin 1，TSP-1）是凝血酶敏感蛋白類中的一種，在DCs中表達和分泌的TSP-1的主要作用是抑制DCs的成熟以及影響其分泌細胞因子的功能［10，11］。TSP-1 產(chǎn)生免疫抑制的功能在調(diào)節(jié)免疫平衡方面不可或缺，但也可能使腫瘤細胞處于更有利的生長環(huán)境。

因此，研究腦膠質(zhì)瘤對樹突狀細胞TSP-1表達水平和表型及功能的影響，對揭示膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞與免疫細胞相互作用的機制必不可少，同時也為腦膠質(zhì)瘤的免疫治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和胰蛋白酶和、optiMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。ELISA試劑盒購自深圳市達科為生物技術股份有限公司。雙抗（青霉素+鏈霉素）購自Sigma-Aldrich公司。Lipofectamine 3000、P 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司?？筎SP1抗體、HRP-山羊抗兔IgG抗體均購自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)母細胞瘤組織切碎，用無菌的胰蛋白酶消化并分離得到膠質(zhì)母細胞瘤原代細胞（以下簡稱“腫瘤細胞”）。腫瘤細胞培養(yǎng)于含10%（體積比）FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞隔1～2天更換培養(yǎng)基，每3天傳代培養(yǎng)1次。

1.2.2 單核細胞的分離和誘導 用Ficoll人外周血淋巴細胞分離液以密度梯度離心法從外周血中分離出單核細胞，用靶向CD14分子的免疫磁珠純化單核細胞，使其純度達95%以上。經(jīng)過純化的單核細胞培養(yǎng)于含10%FBS、25 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的RMPI 1640培養(yǎng)基中。細胞隔2天換液，培養(yǎng)至第6天，單核細胞已被誘導至未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells，iDCs）階段，去除培養(yǎng)基，mDC組加入含10%FBS的RMPI 1640培養(yǎng)基，DC+TCM組加入等量含10%FBS和20%（體積比）TCM的RMPI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。第7天均更換為含10%FBS和10 μg/mL LPS的RMPI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將iDCs誘導為成熟樹突狀細胞（mature dendritic cells，mDCs）。

1.2.3 TSP-1小干擾RNA轉(zhuǎn)染 DC+TCM+Si-TSP-1組DCs在加入TCM培養(yǎng)24 h后，取其種于24孔板，貼壁生長12～18 h，細胞密度達80%。按照艾基siRNA轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染。在15 mL離心管中加入200 μL optiMEM培養(yǎng)基，根據(jù)轉(zhuǎn)染孔數(shù)加入3 μL/孔的Lipofectamine 2000試劑，混勻靜置5 min；在另一個15 mL離心管中加入200 μL optiMEM培養(yǎng)基，加入3 μL/孔的siRNA，5 min后將Lipofectamine 2000懸液與siRNA懸液混合，靜置30 min。最后將混合液加入600 μL含10%FBS的RMPI 1640培養(yǎng)基中，混勻后加入24孔板，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)DCs，8 h后更換為含10%FBS和10 μg/mL LPS的RMPI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)誘導培養(yǎng)48 h。

1.2.4 TSP-1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 mDC+TSP-1組DCs在加入TCM培養(yǎng)24 h后，取其種于24孔板，貼壁生長12～18 h，細胞密度達80%。按照艾基過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染。在15 mL離心管中加入200 μL optiMEM培養(yǎng)基，根據(jù)轉(zhuǎn)染孔數(shù)加入3 μL/孔的Lipofectamine 2000試劑，混勻靜置5 min；在另一個15 mL離心管中加入200 μL optiMEM培養(yǎng)基，加入 3 μL/孔的 TSP-1 質(zhì)粒和 6 μL/孔的P3000試劑，5 min后將Lipofectamine 2000懸液與TSP-1質(zhì)粒懸液混合，靜置30 min。最后將混合液加入600 μL含10%FBS的RMPI 1640培養(yǎng)基中，混勻后加入24孔板，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)DCs，8 h后更換為含10%FBS和10 μg/mL LPS的RMPI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)誘導培養(yǎng)48 h。

1.2.5 Western blot檢測 用移液器吹打懸浮的mDCs并收集，裂解獲取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組各取10 μg蛋白加入4×Loading buffer于98℃干浴鍋變性5 min。配制SDS聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，將樣品和marker加入各孔道，90 V恒壓下電泳20 min后，將電壓調(diào)至120 V，電泳1 h；然后以250 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。之后將PVDF膜用5%（質(zhì)量分數(shù)）牛奶封閉2 h，將對應分子量大小的條帶置于 TSP-1（1∶1000）GAPDH（1∶5 000）一抗抗體中，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。將條帶以與一抗來源對應的二抗于室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。最后加入化學發(fā)光劑顯色，用拍照和分析結(jié)果。

1.2.6 流式細胞術 用PBS洗滌收集到的mDCs并重懸為單細胞懸液，每組均分為3管（1個對照管和2個檢測管），向每管加入細胞活性染料，向2個檢測管加入不同的熒光抗體（抗人HLA-DR、CD80、CD83和CD86），室溫避光孵育30分鐘，PBS洗滌后以200 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.2.7 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附劑測定） 收集各組DCs培養(yǎng)上清，以10 000 rpm離心5 min，留取上清。按照說明書的方法，配制不同細胞因子（IL-10、IL-12p70和TNF-α）的標準品并繪制標準曲線，依照實驗分組對樣品進行測量，并代入標準曲線求出對應濃度。

1.2.8 統(tǒng)計學分析 所有實驗均至少重復進行3次。使用GraphPad Prism 8.0.2對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和制圖。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差的方式表示。利用Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。兩組之間統(tǒng)計分析采用t檢驗。當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤細胞可抑制樹突狀細胞成熟

在誘導培養(yǎng)樹突狀細胞的過程中，加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清TCM。流式細胞分析結(jié)果（圖1A、1B）顯示，加入TCM使樹突狀細胞的成熟度標志HLA-DR和CD83下調(diào)，而CD80和CD86則變化不明顯。上述結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細胞可抑制樹突狀細胞的成熟。

2.2 膠質(zhì)瘤細胞誘導樹突狀細胞分泌IL-10，抑制樹突狀細胞分泌IL-12p70和TNF-α

通過ELISA法對不同培養(yǎng)條件樹突狀細胞的培養(yǎng)上清中幾種不同細胞因子的水平進行檢測。結(jié)果（圖1C）發(fā)現(xiàn)，加入TCM使樹突狀細胞Th2型細胞因子IL-10分泌增加（P＜0.01），而Th1型細胞因子 IL-12p70（P＜0.05）和 TNF-α（P＜0.05）分泌減少。上述結(jié)果說明，TCM使樹突狀細胞的功能向抑制免疫的方向分化。

2.3 膠質(zhì)瘤細胞誘導樹突狀細胞表達TSP-1進而抑制其成熟及正常功能

基于前述結(jié)果，針對樹突狀細胞培養(yǎng)條件的不同，我們對兩種不同處理的樹突狀細胞（mDC組和DC+TCM組）進行了全RNA測序（共1對樣品），以揭露TCM是通過影響樹突狀細胞的哪種基因的水平從而抑制其成熟的。通過KEGG通路分類和表達量聚類分析（圖2A-D），我們篩選出TSP-1這一差異表達基因進行探究。Western blot結(jié)果（圖2E）顯示，加入TCM后，樹突狀細胞TSP-1的表達水平明顯升高。以上結(jié)果證明，TSP-1可能參與了TCM抑制樹突狀細胞成熟的過程。

為了明確樹突狀細胞成熟度的改變與TSP-1水平的改變有無因果關系，我們進而對樹突狀細胞加以不同處理，下調(diào)TCM組樹突狀細胞TSP-1的表達，上調(diào)NC組樹突狀細胞TSP-1的表達，最后檢測不同組別樹突狀細胞的成熟度以及TSP-1的表達水平。如Western blot結(jié)果（圖3A）和流式細胞分析結(jié)果（圖3B、3C）所示，膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清使樹突狀細胞TSP-1的表達水平上升，繼而使其HLA-DR和CD83的水平下降，其成熟度降低；在加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清的同時，下調(diào)TSP-1的表達水平，樹突狀細胞HLA-DR和CD83的水平較TCM組有所回升，TSP-1水平的降低部分性地減弱了膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清抑制樹突狀細胞成熟的作用；同理，在正常誘導成熟的同時，上調(diào)TSP-1的表達水平，樹突狀細胞HLA-DR和CD83的水平較NC組有所降低，其成熟度降低。由以上結(jié)果可見，膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清通過誘導樹突狀細胞表達TSP-1增加從而抑制其成熟的。

同時，ELISA結(jié)果（圖3D）顯示，膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清使樹突狀細胞IL-10分泌水平升高（P＜0.05），IL-12p70（P＜0.0001）和TNF-α（P＜0.05）分泌水平下降；在加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清的同時，下調(diào)TSP-1的表達水平，樹突狀細胞的IL-10分泌水平較TCM組有所降低（P＜0.05），而IL-12p70（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.05）的分泌水平有所上升，TSP-1水平的減少部分性地減弱了膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清使樹突狀細胞向抑制免疫方向分化的作用；同理，在正常誘導成熟的同時，上調(diào)TSP-1的表達水平，樹突狀細胞IL-10分泌水平較NC組上升（P＜0.0001），而IL-12p70（P＜0.01）和TNF-α（P＜0.05）的分泌水平下降。由上述結(jié)果可看出，膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)上清通過誘導樹突狀細胞TSP-1表達升高，使其免疫抑制性介質(zhì)分泌增多，而免疫促進性介質(zhì)分泌減少，因而使樹突狀細胞的功能向抑制免疫的方向分化。

3 討論

DCs作為抗原提呈細胞，在人體的體液免疫和細胞免疫過程中發(fā)揮著至關重要的作用。死亡或瀕死的腫瘤細胞的表面表達損傷相關分子模式（DAMPs），DCs通過模式識別受體PRRs（如Toll樣受體 TLRs）檢測 DAMPs［12］，繼而活化成熟。成熟的重要標志是共刺激分子HLA-DR、CD80、CD83和CD86的表達增多，以及促進T淋巴細胞增殖和分化的炎性細胞因子（如IL-12p70和TNF-α）分泌增多，信號得以傳遞至T淋巴細胞，從而激活一系列免疫反應。

但是在許多腫瘤中，DCs的活化成熟受到了抑制。M.MA等［4］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和胰腺癌中，腫瘤源性的粒細胞刺激因子下調(diào)分化為經(jīng)典樹突狀細胞1 cDC1的祖細胞中的IRF8表達水平，使cDC1的比例下降，從而削弱了cDC1對CD8+T淋巴細胞的激活作用，使腫瘤產(chǎn)生免疫耐受。H.KM等［13］通過體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤來源的TGFβ1和VEGF-A可抑制脾DCs的成熟和激活；同時，在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，肺組織中DCs的成熟和激活也受到了抑制。因此，研究膠質(zhì)瘤細胞與DCs的相互作用，有助于揭示膠質(zhì)瘤疾病產(chǎn)生免疫耐受的機制，也對開發(fā)膠質(zhì)瘤新療法有著重要的指導意義。

有文獻報道，TSP-1可抑制樹突狀細胞的活化成熟。D.V等［11］發(fā)現(xiàn)，TGF-β和PGE2等介質(zhì)可上調(diào)iDCs及mDCs中TSP-1的分泌，在DCs通過TLRs結(jié)合識別相應配體的早期活化階段，TSP-1的分泌增加使DCs中IL-12p70和TNF-α的合成減少；而在DCs與T淋巴細胞相互作用的晚期活化階段，IL-12p70和TNF-α的分泌也受到了抑制。該研究揭示了TSP-1在DCs維持自身抗原耐受和終止炎癥反應中都起著重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，TCM使DCs的TSP-1表達升高，使其分泌的IL-10增加，而IL-12p70和TNF-α減少，繼而使DCs對T淋巴細胞的刺激作用受到抑制，這可能是膠質(zhì)瘤產(chǎn)生免疫耐受的一種機制。

在S.RE等［14］對過敏性眼病的研究中，通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)TSP-1缺失的DCs可引起繼發(fā)性T淋巴細胞反應及最終引發(fā)過敏性眼病的發(fā)生，而人為補充TSP-1對過敏性眼病有治療作用。與之類似，在W.TY［15］等的研究中，針對肺癌和膀胱癌荷瘤小鼠進行DCs中TSP-1的敲除，腫瘤浸潤的CD4（+）和CD8（+）T淋巴細胞明顯增加，同時DCs分泌的IL-12和IFN-γ顯著升高，這兩種細胞因子都是刺激細胞毒性T淋巴細胞CTLs所需的。這些進一步佐證了TSP-1在抑制DCs成熟和發(fā)揮免疫功能中的關鍵作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，TCM通過上調(diào)DCs的TSP-1水平，使其共刺激分子HLA-DR和CD83表達降低，這些共刺激分子是DCs刺激T淋巴細胞必不可少的信號分子；TCM使DCs分泌Th1型細胞因子減少，分泌Th2型細胞因子增多，使Th1/Th2平衡向Th2細胞占優(yōu)勢狀態(tài)的方向漂移。因此，膠質(zhì)瘤通過影響DCs中TSP-1的表達，最終可能影響T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，從而引起腫瘤免疫耐受。而這其中的具體機制仍有待我們的進一步探索。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤細胞通過上調(diào)樹突狀細胞TSP-1的水平，引起其成熟度降低，有助于闡明膠質(zhì)瘤發(fā)生免疫耐受的相關機制，并為膠質(zhì)瘤的免疫治療提供新的探索角度。