譚瑩， 練國(guó)達(dá)， 陳少杰， 李佳佳， 陳尚祥， 黃開紅， 陳茵婷

直腸癌是常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤，腫瘤的轉(zhuǎn)移常使患者失去完全切除腫瘤的手術(shù)機(jī)會(huì)，降低了直腸癌的預(yù)后［1］。針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究十分重要。已知組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP1）存在兩種作用模式，一方面，TIMP1通過(guò)結(jié)合膜受體CD63激活胞內(nèi)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)功能［2-4］；另一方面，TIMP1作為金屬蛋白酶（metalloproteinases，MMPs）的抑制劑被人們熟知，TIMP1與MMPs之間的動(dòng)態(tài)平衡，維持著細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5，6］。有文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌中，TIMP1 與 SERPINE1相關(guān)，而SERPINE1與EMT密切相關(guān)，TIMP1影響SERPINE1從而影響腫瘤轉(zhuǎn)移［7］。TIMP1在多種腫瘤中高表達(dá)，且因其與預(yù)后密切相關(guān)，還可作為腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)因子［8-11］。然而，TIMP1在直腸癌中的表達(dá)水平及是否能預(yù)測(cè)直腸癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后研究較少。

EFEMP1是纖維蛋白糖蛋白家族中的一員，其主要功能是維護(hù)基膜穩(wěn)定性及細(xì)胞外基質(zhì)完整性。有文獻(xiàn)報(bào)道，在肺癌、肝癌和鼻咽癌中，EFEMP1可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤的預(yù)測(cè)因子［12-14］。在宮頸癌和骨肉瘤中，EFEMP1可通過(guò)誘導(dǎo)EMT從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［15，16］。然而 EFEMP1在直腸癌中的研究相對(duì)較少。

本研究旨在探討TIMP1在直腸癌中的表達(dá)水平，以及TIMP1表達(dá)量在不同臨床分期間的差異，探討TIMP1與直腸癌預(yù)后的關(guān)系。探討與TIMP1相關(guān)的差異基因的分子功能及生物學(xué)功能。從而探討TIMP1與EFEMP1的相關(guān)性，以及EFEMP1在直腸癌中的表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

直腸癌癌旁組織與癌組織各個(gè)基因表達(dá)量及臨床資料來(lái)自于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）。

1.2 數(shù)據(jù)分析方法

分析正常組織與直腸癌組織不同臨床分期間的TIMP1的表達(dá)差異，分析TIMP1表達(dá)水平與直腸癌患者總體生存時(shí)間與無(wú)瘤生存時(shí)間之間的關(guān)系。利用 Decenter，參數(shù)設(shè)置為 log2FC＞1，F(xiàn)DR＜0.05，篩選正常組織與直腸癌組織的差異基因，繪制火山圖。根據(jù)TIMP1的表達(dá)量，將直腸癌患者分為TIMP1高表達(dá)組與TIMP1低表達(dá)組，利用Decenter，參數(shù)設(shè)置為log2FC＞1，F(xiàn)DR＜0.05，篩選兩組的差異基因，繪制火山圖與熱圖。將差異基因進(jìn)行基因富集分析，利用FUNRICH進(jìn)行細(xì)胞成分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF），生物過(guò)程（biological process，BP），生物通路（biological pathway）分析。尋找與TIMP1功能可能密切相關(guān)的基因，利用Origin 2018分析TIMP1與EFEMP1的相關(guān)性。分析EFEMP1表達(dá)水平與直腸癌患者總體生存時(shí)間與無(wú)瘤生存時(shí)間之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

TIMP1的表達(dá)水平經(jīng)四分位數(shù)分成四等份并繪制箱式圖進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位間距）表示，采用T檢驗(yàn)與秩和檢驗(yàn)。使用Kaplan-Meier生存分析來(lái)繪制OS及PFS曲線，并采用Logrank檢驗(yàn)比較不同表達(dá)水平的生存差異從而得出P值。

2 結(jié)果

2.1 TIMP1在正常組織與直腸癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系

如圖1A所示，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中10例直腸正常組織TIMP1表達(dá)量為51.03（42.58，59.40），165例直腸癌組織中TIMP1表達(dá)量為174.39（130.71，242.09）。直腸癌組織中TIMP1表達(dá)量高于正常組織（P＜0.05）。如圖1B所示，30例Ⅰ期患者TIMP1表達(dá)量 152.48（107.13，203.03），50例Ⅱ期患者TIMP1表達(dá)量 176.84（130.73，235.22），51例Ⅲ期患者 TIMP1表達(dá)量 195.35（133.00，296.44），24例Ⅳ期患者 TIMP1表達(dá)量 185.65（144.92，223.03）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期直腸癌組織中TIMP1水平均明顯高于正常組織（P＜0.05），而各分期之間TIMP1表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。生存曲線分析顯示，TIMP1高表達(dá)患者OS與PFS均明顯低于低表達(dá)患者（P＜0.05）（圖1C、D）。

2.2 TIMP1相關(guān)的差異基因篩選及基因富集分析

將患者分為TIMP1高表達(dá)組與低表達(dá)組，篩選出差異基因，隨后繪制火山圖（圖2A）。將差異基因進(jìn)行基因富集分析。細(xì)胞成分分析結(jié)果顯示，差異基因大多表達(dá)細(xì)胞外蛋白，與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)（圖3A）。分子功能分析結(jié)果顯示，差異基因表達(dá)蛋白主要參與構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)，細(xì)胞黏附分子活動(dòng)，細(xì)胞生長(zhǎng)活動(dòng)，蛋白抑制活動(dòng)，鈣離子結(jié)合等（圖3B）。生物過(guò)程分析結(jié)果顯示，差異基因表達(dá)蛋白主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程，信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程等（圖3C）。生物通路分析結(jié)果顯示，差異基因主要與EMT通路相關(guān)（圖3D）。在TIMP1高表達(dá)組與低表達(dá)組的差異基因中，選取與EMT相關(guān)的23個(gè)基因，繪制熱圖（圖2B）。篩選出差異基因篩選在正常組織與直腸癌組織中存在表達(dá)差異的基因，繪制火山圖（圖2C）。綜合篩選出9個(gè)，在正常組織與直腸癌組織中存在表達(dá)差異，且與TIMP1相關(guān)的EMT相關(guān)基因：EFEMP1、Fibulin-1（FBLN1）、生長(zhǎng)停滯特異性1（growth arrest specific 1，GAS1）、雙糖鏈蛋白多糖（biglycan，BGN）、視黃酸受體應(yīng)答蛋白 2（Retinoic acid receptor responder protein 2，RARRES2）、泛素羧基末端水解酶L1（Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1，UCHL1）、前列環(huán)素合酶（prostacyclin synthase，PTGIS）、耳蝸背核（the dorsal cochlear nucleus，DCN）、細(xì)胞色素P450 1B1（Cytochrome P450 1B1，CYP1B1）。

2.3 EFEMP1與TIMP1的相關(guān)性及EFEMP1與直腸癌預(yù)后的關(guān)系

如圖4A所示，EFEMP1隨著TIMP1表達(dá)量升高而降低，EFEMP1與TIMP1呈正相關(guān)相關(guān)（r=0.2795，P＜0.05）。如圖4B所示，EFEMP1高表達(dá)患者總體生存時(shí)間低于低表達(dá)患者（P＜0.05）。如圖4C所示，EFEMP1高表達(dá)患者無(wú)瘤生存時(shí)間低于低表達(dá)患者（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示直腸癌組織中TIMP1表達(dá)水平高于正常組織，不同臨床分期直腸癌組織均高于正常組織。TIMP1高表達(dá)組預(yù)后差于TIMP1低表達(dá)組，驗(yàn)證了此前報(bào)道的TIMP1為結(jié)直腸癌的標(biāo)記物?；蚋患治鲲@示，根據(jù)TIMP1表達(dá)量篩選出的差異基因，其功能與細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性及EMT相關(guān)。EMT指上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因或表觀遺傳水平改變，上皮標(biāo)志物表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，失去細(xì)胞間緊密連接和細(xì)胞極性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。一方面，TIMP1可阻斷MMPs的功能，從而維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。另一方面，TIMP1還可與SERPINE1等EMT相關(guān)分子相互作用，從而影響腫瘤細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

在根據(jù)TIMP1表達(dá)量篩選出的差異基因中，進(jìn)一步篩選出在正常組織與直腸癌組織中存在表達(dá)差異的基因。最后得到9個(gè)基因：EFEMP1、FBLN1、GAS1、BGN、RARRES2、UCHL1、PTGIS、DCN、CYP1B1。其中，EFEMP1與EMT密切相關(guān)，一方面，在骨肉瘤等腫瘤中，敲低EFEMP1可上調(diào)E-鈣黏素（E-cadherin）表達(dá)，抑制N-鈣黏素（N-cad-herin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail、Slug和Twist的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。另一方面，在子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中，EFEMP1與E-cadherin呈正相關(guān)，與Vimentin，Snail and β-catenin呈負(fù)相關(guān)［17］。本研究結(jié)果顯示，在直腸癌組織中，EFEMP1高表達(dá)患者OS與PFS均明顯低于低表達(dá)患者。說(shuō)明EFEPM1在直腸癌中可能通過(guò)促進(jìn)EMT起到促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。EFEPM1與直腸癌預(yù)后相關(guān)，可將EFEPM1作為直腸癌標(biāo)志物，預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后情況。結(jié)果顯示TIMP1在直腸癌中高表達(dá)，且TIMP1與EFEMP1存在正相關(guān)，說(shuō)明可能存在TIMP1激活EFEMP1的表達(dá)從而促進(jìn)EMT，進(jìn)而促進(jìn)直腸癌的轉(zhuǎn)移，此假設(shè)有待進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

表1 TIMP1表達(dá)水平與臨床資料

表2 TIMP1高表達(dá)組與低表達(dá)組的差異基因中與EMT相關(guān)的部分基因

表3 EFEMP1表達(dá)水平與臨床資料

綜上，TIMP1在直腸癌中高表達(dá)，且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。EFEPM1與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。而TIMP1與EFEPM1存在相關(guān)性。TIMP1與EFEPM1可作為直腸癌的標(biāo)記物及預(yù)測(cè)因子。