伍耀豪， 劉寶寧， 陳露平， 曾樂祥， 邱榮林， 張杰， 蘇健航，廖敏儀， 周軍， 鄧小耿*

先天性巨結(jié)腸（hirschsprung"s disease，HD）是一種常見的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病。因相關(guān)基因突變?nèi)笔Щ蚓植课h(huán)境的改變使神經(jīng)母細(xì)胞在腸道遷移分化受阻，導(dǎo)致直腸結(jié)腸腸壁缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，病變腸管喪失蠕動功能而持續(xù)痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管代償性肥厚擴(kuò)張。目前，HD以手術(shù)治療為主，即切除無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸管后再行腸吻合術(shù)。隨著手術(shù)技術(shù)的不斷進(jìn)步，特別是近年來腹腔鏡技術(shù)的發(fā)展，大大減少了手術(shù)創(chuàng)傷，明顯改善患兒術(shù)后的生活質(zhì)量，但便秘復(fù)發(fā)、失禁（污糞）、肛門狹窄以及小腸結(jié)腸炎等術(shù)后并發(fā)癥仍有發(fā)生［1］。對全結(jié)腸型巨結(jié)腸或者巨結(jié)腸類源病患者，國內(nèi)外仍無理想的治療措施。

細(xì)胞移植是近年來HD治療的研究熱點之一，在2016年發(fā)布的腸神經(jīng)疾病治療指南中指出，HD是干細(xì)胞移植治療的目標(biāo)疾病［2］。盡管現(xiàn)有研究已成功的從廢棄腸道組織中分離培養(yǎng)出腸神經(jīng)干細(xì)胞［3］，然而，從患兒腸道內(nèi)獲取腸神經(jīng)干細(xì)胞具有較大的創(chuàng)傷性，腸神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量也非常有限，不能滿足細(xì)胞移植治療需要。因此，有必要尋找一種來源豐富的種子細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源廣泛，取材損傷小，其成神經(jīng)分化、成骨分化、成軟骨分化和成脂分化等多向分化潛能早已得到驗證［4，5］。最近的實驗研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs在局部微環(huán)境中分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如 BDNF、PDGF-AB、VEGF、HGF、TGF-β、IGF-1、b-FGF，從而起到保護(hù)現(xiàn)存神經(jīng)細(xì)胞功能、促進(jìn)周圍神經(jīng)再生和降低局部組織炎癥反應(yīng)的作用，可應(yīng)用于修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、脊髓神經(jīng)損傷、神經(jīng)性耳聾和坐骨神經(jīng)損傷［7-12］。因此，ADSCs可能是治療先天性巨結(jié)腸腸神經(jīng)細(xì)胞缺失的理想種子細(xì)胞。目前國內(nèi)外尚未見應(yīng)用ADSCs轉(zhuǎn)分化成腸神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)報道。本研究探討應(yīng)用小分子SB431542、noggin和LDN1931897將大鼠ADSCs轉(zhuǎn)分化成腸神經(jīng)樣干細(xì)胞（enteric neural-like stem cells，ENLSC）的可行性，希望能夠為HD的細(xì)胞治療提供一種潛在的種子細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 4周SD大鼠18只，體重約100 g，隨機(jī)分成實驗組及對照組，每組9只。E15d的SD孕鼠9只。購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（Hyclone公司，澳大利亞），血清替代物（knock out serum replacement，KOSR）（ Gibco 公司，美國），兔抗大鼠Sox2，Nestin抗體（Santa Cruz公司，美國），SB431542（BioVision公司，美國），noggin（PeproTech公 司 ，美 國），LDN1931897（Adooq Bioscience，美國），B27（Gibco公司，美國），N2（Gibco公司，美國），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（santa，美國）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng)鑒定參考本研究組前期文獻(xiàn)方法進(jìn)行［4，5］。取SD大鼠腹股溝脂肪組織，0.1%Ⅰ型膠原酶消化計數(shù)，以5×104有核細(xì)胞/cm2細(xì)胞密度接種，DMEM+10%FBS培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)至第三代。

1.2.2 ADSCs轉(zhuǎn)分化實驗 將第三代ADSCs接種在DMEM/F12培養(yǎng)基中，添加3%KOSR，1%Glutamax，1%非必需氨基酸和4 ng/mL bFGF，10 μM SB431542，100 ng/mL noggin 和 0.5 μM LDN 193289，培養(yǎng) 7天。培養(yǎng)基中添加2%B27，1%N2，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF和胎腸培養(yǎng)液（培養(yǎng)液配制參照文獻(xiàn)［6］），分別培養(yǎng)7天和14天。對照組為未誘導(dǎo)ADSCs。

1.2.3 腸神經(jīng)樣干細(xì)胞的鑒定 ①形態(tài)學(xué)鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)；②細(xì)胞增殖生長情況鑒定：將轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)14天的ENLSC消化成單個細(xì)胞進(jìn)行CCK-8試驗，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度（OD值），檢測ENLSC的生長情況；③免疫熒光鑒定：檢測Nestin、Sox2等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組數(shù)據(jù)比較應(yīng)用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)動態(tài)觀察

ADSCs向ENLSC轉(zhuǎn)分化過程中細(xì)胞形態(tài)變化過程見圖1。ADSCs在神經(jīng)培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)分化懸浮培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)分化的ADSCs表現(xiàn)出神經(jīng)干細(xì)胞的行為特性，形成許多神經(jīng)球樣的細(xì)胞團(tuán)塊。將神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入腸神經(jīng)培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，可見細(xì)胞再次聚集成團(tuán)生長，細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞變成圓形或者橢圓形。在誘導(dǎo)14天后形成類似于神經(jīng)球樣的細(xì)胞聚合物，有長長的突起“錨”在培養(yǎng)皿底面，與周圍貼壁細(xì)胞相互形成網(wǎng)絡(luò)連接。對照組僅見貼壁的梭形脂肪干細(xì)胞生長，未見細(xì)胞聚集成團(tuán)。

2.2 CCK-8法檢測ENLSC生長曲線

將轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14天的ENLSC和未誘導(dǎo)的ADSCs，利用CCK-8法測得ENLSC在1、2、3、4、5、6和7天等7個時間點的OD值，作出實驗組和對照組的生長曲線。由圖2可知，在轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)7天，ENLSC生長增殖趨勢良好。與對照組比較，兩組無明顯差異（P=0.084）。說明經(jīng)過轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)后的ENLSC仍然能夠保持良好的增殖分化能力。

2.3 免疫熒光染色檢測ENLSC的腸神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物

對誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化14天和21天的ENLSC進(jìn)行巢蛋白（Nestin）和Sox2免疫熒光染色，見圖3。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化第14天和第21天，熒光顯微鏡下可見ENLSC均呈現(xiàn)Nestin陽性表達(dá)。第21天Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量和強度均較第14天明顯。對照組在第14天和第21天均未見Nestin陽性表達(dá)。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化第14天和第21天，熒光顯微鏡下可見ENLSC均有Sox2陽性表達(dá)，細(xì)胞間可見細(xì)小的突觸連接。對照組在第14天和第21天均未見Sox2陽性表達(dá)。

3 討論

HD的病因主要是直結(jié)腸腸壁的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，細(xì)胞移植治療在HD神經(jīng)功能修復(fù)重建中具有巨大的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的研究主要是通過體外增殖誘導(dǎo)分化神經(jīng)干細(xì)胞或者腸神經(jīng)干細(xì)胞成腸神經(jīng)細(xì)胞作為細(xì)胞移植的細(xì)胞來源。由于腸神經(jīng)細(xì)胞是一種成熟終末分化細(xì)胞，其缺乏自我增殖分化能力，移植后只能暫時存活于被移植組織中，移植效果不理想。因此，具有自我增殖和分化能力的干細(xì)胞移植才是理想的治療方式。

近年，有學(xué)者應(yīng)用9種小分子將小鼠成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為小鼠NSCs，揭示了僅使用小分子產(chǎn)生人神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的可行性［13，14］。小分子還能促進(jìn)人ADSCs分化成表達(dá)Sox1，Pax6和NF-H的神經(jīng)元樣細(xì)胞［15］。Park J等認(rèn)為由于小分子激活體內(nèi)特定的細(xì)胞轉(zhuǎn)化通路機(jī)制產(chǎn)生靶細(xì)胞的方式與體內(nèi)類似，使用小分子激活內(nèi)源性神經(jīng)基因來產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞更安全和更穩(wěn)定［16］。我們的實驗初步提示了ADSCs在小分子SB431542、noggin和LDN1931897的共作用下呈現(xiàn)出類似神經(jīng)干細(xì)胞的行為特征。由原來的長梭形細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成圓形或者橢圓形，最后形成許多神經(jīng)球樣的細(xì)胞團(tuán)塊。ENLSC陽性表達(dá)Nestin，一種中間絲蛋白，在哺乳動物神經(jīng)前體細(xì)胞中高表達(dá)，是神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，提示轉(zhuǎn)分化細(xì)胞正處于干細(xì)胞階段［14］。在體外擴(kuò)增培養(yǎng)時，ENLSC所表現(xiàn)的增殖能力與未誘導(dǎo)的ADSCs無明顯差異，說明ENLSC能保持良好的自我增殖能力。

雖然腸神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物仍存在爭議，但Heanue TA等在腸神經(jīng)系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，Sox2在腸神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞中表達(dá)，并認(rèn)為可作為腸神經(jīng)干細(xì)胞識別和篩選的新標(biāo)志［17］。Sox2是脊椎動物早期發(fā)育中最早表達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)特異性基因之一，同時在干細(xì)胞的維持中也起著關(guān)鍵作用，并常被作為一種多能性細(xì)胞譜系的分子標(biāo)記。Sox2基因也廣泛存在于神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和少數(shù)成熟神經(jīng)元中，是神經(jīng)功能決定因子和神經(jīng)干細(xì)胞特性維持所必需的［18］。我們誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化第14天和第21天的ENLSC均穩(wěn)定表達(dá)Sox2，提示轉(zhuǎn)分化細(xì)胞具有腸神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物陽性表達(dá)。

綜上所述，我們應(yīng)用小分子SB431542、noggin和LDN1931897轉(zhuǎn)分化獲得的ENLSC能夠表現(xiàn)出腸神經(jīng)干細(xì)胞的部分特征，具有良好的增殖能力，可能能夠為腸神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞移植治療提供一種潛在的種子細(xì)胞來源。然而，腸神經(jīng)干細(xì)胞移植的最終目標(biāo)是恢復(fù)移植腸道的功能，本研究仍有許多不足之處。比如，ENLSC是否能夠進(jìn)一步分化成功能性的腸神經(jīng)細(xì)胞，是否能夠定植存活在被移植腸管仍有待進(jìn)一步的實驗驗證。