姚奇， 何蘭珍

結直腸癌腫瘤是目前我國高發(fā)的惡性腫瘤之一［1］。深入研究結直腸癌的基因分子結構變化機制，尋找新的結直腸癌治療手段和方法是目前腫瘤研究的一個熱點。腫瘤侵襲和細胞轉移是可能導致結直腸患者死亡的主要危險原因［2］。膠原蛋白家族是構成基底膜的重要結構性成分［3］。近來研究報告中發(fā)現(xiàn)，IV型結直腸癌膠原蛋白家族α1（collagentypeⅳalpha1，COL4A1）在胃癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中異常地表達，并與腫瘤的發(fā)生及其發(fā)展、轉移等密切相關［4-6］。但目前國外有關COL4A1基因在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用的研究較少。本研究主要采用了挖掘公開的結直腸癌生物化學數(shù)據(jù)庫的研究方法，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫［7］、GEPIA數(shù)據(jù)庫［8］、MethHC甲基化數(shù)據(jù)庫［9］和String在線公開數(shù)據(jù)庫［10］等綜合分析了COL4A1基因在結直腸癌中的表達和預后情況，分析其可能參與的機制，為進一步COL4A1基因在結直腸癌中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 COL4A1基因在腫瘤組織中的表達

Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫平臺是一個腫瘤基因芯片篩選數(shù)據(jù)庫和基因整合數(shù)據(jù)庫收集和挖掘的平臺，注冊后用戶可在基因芯片數(shù)據(jù)庫中根據(jù)用戶需求自動設定關鍵篩選的條件。本研究首先將篩選條件設定為：gene：COL4A1，analysis type：cancer vs.normal analysis，data type：mRNA。通過Oncomine在線公開數(shù)據(jù)庫分析COL4A1基因在不同人類腫瘤中的表達情況。然后增加篩選條件：cancer type：coloncarcinoma，threshold by P＜0.05，foldchange：all，generank：all

1.2 COL4A1基因與結直腸癌的臨床病理分級和預后的關系

GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大學研制開發(fā)的用于整合分析癌癥表達譜數(shù)據(jù)的交互式web服務器，包含了TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫的33種惡性腫瘤，共有9736個腫瘤樣本和8587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)。在本研究中，我們應用GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證之前應用Oncomine數(shù)據(jù)庫所得出的相關結果，并用GEPIA數(shù)據(jù)庫中包含TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，分析COL4A1基因的表達水平與病理分級、生存預后的關系。

1.3 COL4A1基因的甲基化分析

MethHC數(shù)據(jù)庫整合了TCGA數(shù)據(jù)庫中人類腫瘤基因組的甲基化數(shù)據(jù)，基于此分析COL4A1基因甲基化與結腸腺癌的相關性。檢索條件限定如下：①search by：gene；②cancer：COAD&READ；③Select a gene region：Promoter；④select a methylationlevelevalution method：Average；⑤ Gene：COL4A1.

1.4 String蛋白網絡分析

應用String蛋白網絡（https：//string-db.org/）分析可預測蛋白質與蛋白質相互調控網絡，通過String數(shù)據(jù)庫預測COL4A1蛋白的上下游調控蛋白及蛋白間的相關調控關系。本研究中輸入檢索條件：①Protein Name：COL4A1；②物種類型：homo sapiens。

2 結 果

2.1 COL4A1在不同腫瘤類型中的差異性表達

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中共檢索得到441個不同的類型惡性腫瘤的統(tǒng)計結果（參見圖1A），其中大約有74個統(tǒng)計結果顯示COL4A1高表達，原發(fā)性腦腫瘤、中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸部乳腺癌、腎癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌、卵巢癌、肉瘤及其他惡性腫瘤等；5個臨床檢查結果顯示其惡性腫瘤可能低表達，且主要表現(xiàn)集中在包括膀胱癌、肺癌、黑素瘤、肉瘤等原發(fā)性癌癥。

2.2 COL4A1基因在結直腸癌中的表達情況

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中對描述結腸腺癌的有關研究進行分析，共有11項符合條件的研究，分別對符合條件的11項研究進行對比分析，發(fā)現(xiàn)每一項研究中結腸腺癌組織中COL4A1基因表達均高于正常對照組織。為了進一步明確兩者的相關性，對11項研究進行薈萃分析，結果顯示結直腸癌組織中COL4A1基因mRNA的表達水平明顯高于正常組織（P=1.29E-5），見圖1B。其中有六項結直腸癌研究結果提示，其表達差異具有顯著性（P＜0.05）。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫，分別在結腸癌與直腸癌組織中進一步驗證COL4A1轉錄水平較正常結腸和直腸組織表達量要明顯增高（P＜0.05，圖2A）。

2.3 COL4A1基因與結直腸癌臨床病理分期、預后的關系

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，我們分析了COL4A1基因表達與結腸癌和直腸癌的臨床病理分期的相互關系，發(fā)現(xiàn)無論是結腸癌還是直腸癌，在不同的腫瘤臨床分期各組間COL4A1 mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義（結腸癌組F=2.3，P=0.0773；直腸癌組F=2.06，P=0.112；見圖2B）。我們再利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進行生存分析發(fā)現(xiàn)COL4A1基因的表達與結直腸癌的生存率和預后無關（P＞0.05）。

2.4 結直腸癌與正常組織中COL4A1基因甲基化水平

在MethHC數(shù)據(jù)庫中，檢索發(fā)現(xiàn)在結直腸癌組織中COL4A1基因有一個轉錄模板NM_001845。分析結果發(fā)現(xiàn)，COL4A1在結腸癌和直腸癌組織中甲基化水平明顯升高（P＜0.005）。甲基化數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)表達量的相關性分析提示：COL4A1在結直腸癌中的表達與甲基化正相關，甲基化數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)差異倍數(shù)的相關性分析提示P＜0.01。見圖3A、3B。

2.5 COL4A1基因主要相關蛋白網絡圖

通過STRING分析獲得COL4A1相關蛋白作用網絡圖，見圖4。COL4A1主要相關蛋白分別為 COL16A1、 SERPINH1、 COL5A2、 COL6A1、COL5A2、COL5A1、COL1A1、COL3A1、COL4A2、COL1A2、ITGA1，且相互作用 score＞0.95。將以上相關蛋白進行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與了細胞外基質組織，膠原蛋白纖維組織，細胞對氨基酸刺激的反應，對酸性化學品的反應，蛋白質異三聚化等生理過程。而信號通路分析預測COL4A1基因可能在ECM受體相互作用、局部粘附等信號通路中發(fā)揮作用。

3 討論

腫瘤細胞的侵襲轉移與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）密切相關［11］。細胞基底膜是由COL4A1蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白構成的一種特殊形式的ECM（12）。基底膜的主成分是COL4A1蛋白。已有研究表明COL4A1基因在乳腺癌中高表達，且在乳腺癌細胞的增殖和集落形成中發(fā)揮關鍵作用［4］。尿路上皮癌細胞中COL4A1基因亦為高表達，且高表達COL4A1基因是其復發(fā)的獨立危險因素［6］。COL4A1基因同樣在胃癌組織中高表達，COL4Al蛋白可能與胃癌細胞ECM受體相互作用，參與胃癌細胞的轉移和侵襲［5］。但目前有關COL4Al在結直腸癌中的表達、預后及可能涉及的機制等研究較少。

為了探索COL4A1基因在結直腸癌中的作用，本研究首先應用Oncomine在線數(shù)據(jù)庫，挖掘COL4A1基因在常見腫瘤中的表達情況。結果顯示，COL4A1在腫瘤組織中高表達的結果有74個，其中有11項研究顯示，COL4A1基因在結直腸癌組織中高表達。薈萃分析顯示，總體上COL4A1基因在結直腸癌組織中的mRNA表達水平高于正常結直腸黏膜組織。有六項結直腸癌研究表明，COL4A1基因mRNA表達水平顯著升高，差異具有顯著性。我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析驗證了Oncomine數(shù)據(jù)庫的結果。據(jù)此推測，COL4A1基因在結直腸癌的發(fā)生過程中可能扮演重要的角色。但隨后的臨床病理分期及預后結果提示，差異無統(tǒng)計學意義。分析可能原因，其一，上述研究結論僅僅是在轉錄水平上得出的，有一定局限性；其二，腫瘤的分期與預后受到多因素共同參與調節(jié)，絕非某一個促癌因子能起到決定性作用，COL4A1的作用可能被其他拮抗因子影響。后續(xù)研究中，通過進一步驗證COL4A1在蛋白水平對結直腸癌生物學行為的影響，探索參與COL4A1的上游調控與修飾的關鍵分子具有重要的科學研究價值。因此我們推測，COL4A1可能在發(fā)生是過程中可能是個關鍵因子。

為了研究影響COL4A1基因在結直腸癌組織中表達差異的可能機制，我們通過MethHC在線數(shù)據(jù)庫分析了結直腸癌組織和正常結直腸黏膜組織中COL4A1基因DNA啟動子區(qū)的甲基化水平的變化，結果顯示：結直腸癌組織中COL4A1基因在DNA啟動子區(qū)的甲基化水平顯著升高，且甲基化水平與COL4A1的表達水平呈正相關（P＜0.01），這一發(fā)現(xiàn)有待于進一步實驗驗證和探討。另外，我們還通過String-DB數(shù)據(jù)庫分析了COLA41可能參與的信號通路及相關作用蛋白，結果發(fā)現(xiàn)：COL4A1蛋白可能在ECM受體相互作用、局部粘附等信號通路中發(fā)揮作用。以上結果進一步提示：COL4A1可能是結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵樞紐基因，通過與ECM受體相互作用，影響著腫瘤細胞的浸潤、轉移等生物學行為。

綜上所述，通過研究分析，COL4A1基因可能參與了結直腸癌的發(fā)生發(fā)展，這些結果需進一步研究證實。