周 斌，王留彬，韓浩蕾，徐新濤，唐 茜，譚禮強

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，成都 611130；2.雷波縣玉竹春茶廠，四川雷波 616561)

中國是茶樹[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]原產(chǎn)地[1]，在西南和華南地區(qū)都有較多的野生茶樹分布，包括橫斷山脈分布區(qū)、滇桂黔分布區(qū)、滇川黔分布區(qū)、南嶺山脈分布區(qū)等[2]。川渝地區(qū)的野生茶樹主要分布在長江、金沙江兩岸，包括雷波、宜賓、瀘州、合江等地區(qū)，及四川盆地的西部邊緣，包括崇州、滎經(jīng)、邛崍、大邑等市縣[3]。經(jīng)過長期的自然選擇，野生茶樹資源中可能蘊含著大量抗逆基因和獨特的品質(zhì)相關(guān)基因，因此對于茶樹遺傳演化、資源保存、分子育種研究有重要意義，部分野生茶樹還可直接用于茶葉加工，具有較大的商業(yè)開發(fā)價值。

茶樹鮮葉內(nèi)的生化成分是形成茶葉色、香、味、形的物質(zhì)基礎(chǔ)，生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與組成的差異直接影響成茶的品質(zhì)、風(fēng)味和適制性。不同的茶樹資源，由于生長環(huán)境及自身遺傳代謝的差異，生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組成有顯著不同[4]，因此開展生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析和評價是茶樹種質(zhì)資源發(fā)掘和利用的前提。通過對野生茶樹資源進行調(diào)查、觀測和生化成分測定，有助于了解該資源的遺傳多樣性，比較資源間生化成分的差異，還可以發(fā)掘特異單株等。

已有學(xué)者對貴州[5-6]、云南[7]、四川[8-9]、廣西[10]等地部分野生茶樹的品質(zhì)成分做了相關(guān)的研究分析，但目前關(guān)于四川雷波野生茶樹資源的生化成分研究還尚未見報道。雷波縣位于四川涼山州地區(qū)，毗鄰云南，是野生茶樹集中分布地之一，根據(jù)課題組的前期考察，在雷波縣羅沙溪鄉(xiāng)銀廠溝村(28°30′10″N，103°29′5″E，海拔1 200～ 1 300 m)附近數(shù)座山上有約133.33 hm2的野生茶樹集中分布區(qū)，以大葉種、小喬木型野生茶樹為主，也有少量小葉種、灌木型野生茶樹，其中部分茶樹高近10 m，主干直徑在20 cm以上的有近百株(圖1)。本試驗從中選取50份資源為研究對象，采其春季一芽二葉制成生化樣并測定了其主要品質(zhì)成分，以探究雷波野生茶樹資源生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)特點及多樣性水平,發(fā)掘育種材料,推動其保護和利用工作。

圖1 雷波縣代表性野生茶樹的形態(tài)照片F(xiàn)ig.1 Morphological features of representative wild tea trees in Leibo county

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了取樣具有代表性，根據(jù)不同區(qū)域(山澗)將雷波縣銀廠溝村約133.33 hm2野生茶樹集中分布區(qū)劃分為4個區(qū)塊。2019年3月下旬，從每個區(qū)塊隨機選取11～16株野生茶樹并編號，共計50株(編號的首位數(shù)字代表采樣區(qū)塊號)，采集各株春季頭輪一芽二葉新梢。

1.2 樣品制備與試驗方法

生化樣的制備依據(jù)《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[11]中的方法進行，即：一芽二葉鮮葉經(jīng)微波殺青后轉(zhuǎn)至80 ℃恒溫干燥箱烘干固樣，將烘干茶樣帶回實驗室用高速磨樣機粉碎，待用。

茶葉含水量的測定采用GB/T 8304—2013中的120 ℃快速烘干法；茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用GB/T 8313—2018中的福林酚比色法；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用GB/T 8314—2013中的茚三酮比色法；咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用GB/T 8312—2013中的紫外分光光度法；水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用GB/T 8305—2013進行測定；兒茶素總量的測定采用香莢蘭素比色法[12]。

1.3 統(tǒng)計分析

每份資源各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均測量3次，采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，進行基本統(tǒng)計分析和聚類分析。變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值，記為CV。采用Shannon-Wiener指數(shù)(H′)[13]計算多樣性指數(shù)，公式為：

H′=-∑ni=1PiLn(Pi)

式中，Pi為某性狀第i種個體數(shù)占總個體的比例，n為個體總數(shù)。計算前先對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，進行10級分類，1級

2 結(jié)果與分析

2.1 生化成分結(jié)果

雷波野生茶樹資源的主要生化成分結(jié)果及基本特征數(shù)據(jù)見表1和表2。50份資源游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.64%～4.29%(占干物質(zhì)量比例，下同)，平均2.58%；咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.75%～ 5.30%，平均4.62%；茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 13.97%～20.82%，平均16.99%；兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.76%～16.12%，平均12.06%；水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.10%～48.60%，平均41.39%；酚氨比為3.41～12.67，平均為7.00。

由表2可知，50份資源的氨基酸、咖啡堿、茶多酚、兒茶素、水浸出物及酚氨比的變異系數(shù)(CV)分別為23.63%、 8.55%、9.50%、14.12%、7.54%、28.58%；多樣性指數(shù)(H′)分別為1.94、2.03、2.00、2.03、2.01、1.98，均值為2.00。

2.2 基于生化成分的聚類分析

以氨基酸、茶多酚、咖啡堿、兒茶素和水浸出物為變量，采用離差平方和法(Ward’s method)，距離為歐氏距離，對50份野生茶樹資源進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。50份資源可劃分為4個類群，各個類群之間生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異(表3)。第1類群數(shù)量最多，由15份資源組成，該類群茶多酚、兒茶素及水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)都最高，酚氨比最大，但氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。第4類群與之相反，該類群包含11份資源，其氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，但茶多酚、兒茶素及水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，酚氨比最小。第2，3類群分別由10、14份資源組成，第2類群咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，第3類群咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，這兩類群其余各生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中。

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。

Note:The data are “average ± standard deviation”.

表2 主要生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的基本統(tǒng)計參數(shù)Table 2 Basic statistical parameters of mass fraction of main biochemical components

圖2 雷波50份野生茶樹資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 50 accessions of wild tea tree germplasms resoruces in Leibo

表3 不同類群資源主要生化成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值Table 3 Average mass fraction of major biochemical components in different groups of resources

2.3 特異、優(yōu)良種質(zhì)資源初步篩選

按照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物優(yōu)異種質(zhì)資源評價規(guī)范-茶樹(NY/T 2031-2011)》[14]對50份資源進行篩選評價。特異種質(zhì)資源(rare germplasm)是指性狀表現(xiàn)特殊的、稀有的種質(zhì)資源。優(yōu)良種質(zhì)資源(elite germplasm)表示主要經(jīng)濟性狀表現(xiàn)好且具有重要價值的種質(zhì)資源。依據(jù)特異種質(zhì)資源的主要生化指標(biāo)：氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥5.0%，高茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥25.0%，低茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤7.5%，兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20.0%，高咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥5.0%，低咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤1.5%；優(yōu)良種質(zhì)資源的主要生化指標(biāo)：氨基酸質(zhì)量分 數(shù)≥4.0%，茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20.0%，對50份野生茶樹資源進行初步篩選，由表4可知，初步篩選出特異資源9份，潛在優(yōu)良資源4份，高水浸出物資源5份。

表4 基于生化成分的資源篩選Table 4 Resource screening based on biochemical components

3 結(jié)論與討論

3.1 雷波野生茶樹資源生化成分特征分析

Chen等[15]對中國596份茶樹種質(zhì)資源的研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為3.3%，茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為28.4%，咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為 4.2%。在本研究中，雷波野生茶樹群體氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為2.58%，茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為 16.99%，咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為4.62%，氨基酸和茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于中國栽培種茶樹的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)。研究證實，野生茶樹的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)相較于栽培茶樹存在偏低的現(xiàn)象[2]，這是由于栽培條件的差異及多年的育種選擇造成的。氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和其他野生茶樹群體資源相比，高于貴州(2.21%)[13]，云南(2.31%～2.48%)[7,16]野生茶樹氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，但低于廣西大瑤山(3.60%)[17]、金秀(3.47%)[18]野生茶樹氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說明雷波野生茶樹的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在野生茶樹群體中處于中等的水平。

值得注意的是，雷波野生茶樹資源咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于栽培種茶樹的咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)。雷波野生茶樹咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)高于貴州[5,13,19-20](2.74%～3.74%)、云南[7,16](3.83%～4.14%)、廣東[21](3.27%)和廣西(3.89%)[22]境內(nèi)野生茶樹咖啡堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并且大部分(76%)資源咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.00%～5.00%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥5.0%的特異資源有9份，占資源總數(shù)的18%，說明該野生茶樹群體資源整體咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，具有較大選育出高咖啡堿資源的潛力。雷波野生茶樹資源兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低僅為 12.06%，低于中國茶樹種質(zhì)資源的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù) (15.45%)[23]，張凱等[24]對川渝地區(qū)野生大茶樹兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究也證實四川的野生大茶樹兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體較低。

3.2 雷波野生茶樹資源生化成分多樣性分析

雷波野生茶樹資源基于生化成分的變異系數(shù)(CV)變化范圍為7.54%～28.58%，平均值為15.32%，其中變異系數(shù)(CV)最大的為酚氨比(28.58%)，其次為氨基酸(23.63%)。遺傳多樣性指數(shù)(H′)為1.94～2.03，平均值為2.00，高于廣西98份茶樹資源的遺傳多樣性指數(shù) (1.90)[10]，與貴州53份野生古茶樹資源 (2.00)[13]，陜西88份茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性指數(shù) (2.01)[25]相當(dāng)。結(jié)果表明，雷波野生茶樹資源的主要生化成分在不同材料間有明顯的差異，變異系數(shù)較大，多樣性指數(shù)高，表現(xiàn)出豐富的多樣性。

通過聚類分析，50份資源可以分為4個類群，各個類群都包含有不同片區(qū)的茶樹，聚類時并未因采樣區(qū)塊的不同而有差異，可能是因為各區(qū)塊地理距離相近，區(qū)域種群間的基因交流沒有受到地理隔離的限制，未對茶樹分化造成明顯影響，并且4個片區(qū)的海拔與土壤營養(yǎng)狀況相似，茶樹生化成分沒有較大差異。

3.3 雷波野生茶樹資源的篩選與保護利用

對野生茶樹開展資源鑒定與評價是獲得特異種質(zhì)資源的基本途徑[26]。本研究基于主要生化成分的差異，可以從50份雷波野生茶樹資源中初步篩選出咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥5.0%的特異資源9份，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥4.0%、茶多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20.0%的優(yōu)良資源3份、1份，高水浸出物(水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥45.0%)資源5份。另外，還發(fā)現(xiàn)LB108、LB208、LB114資源兼具多種優(yōu)良特性，具有較高的育種價值，例如資源LB114其茶多酚、兒茶素、水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50份資源中均為最高，資源LB208咖啡堿和氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較高。

野生茶樹作為重要的育種材料，具有許多目前開發(fā)利用上所急需的優(yōu)異性狀如高咖啡堿、高氨基酸、高抗性等，可以作為茶樹雜交育種，分子輔助育種等育種方式的新材料進行突破性育種，也可以直接篩選優(yōu)良單株，進行扦插繁育加以利用[2]。本試驗對雷波野生茶樹種質(zhì)資源主要生化成分進行了鑒定和評價，結(jié)果表明其生化成分存在較高的遺傳多樣性，并且篩選出15株優(yōu)良單株，以上研究結(jié)果可以為今后茶樹育種提供新的材料或直接利用奠定基礎(chǔ)。該群體資源咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，也可直接作為工業(yè)提取天然咖啡堿的原料。

目前，雷波地區(qū)野生茶樹的管理和保護措施還較為薄弱，存在過度采摘、砍伐的現(xiàn)象，少部分茶樹受到病蟲草害的較大影響，造成了部分珍稀資源的流失，因此野生茶樹資源的保護工作需進一步加強，可通過建立核心保護區(qū)、制定野生茶樹的管理辦法和技術(shù)方案、向民眾普及野生茶樹資源保護的重要性等措施實現(xiàn)珍稀資源的保護和 利用。