馮 岳，魏永勝，馮 浩

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.中國科學(xué)院 植物研究所光生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 100093；3.中國科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 國家節(jié)水灌溉楊凌技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100)

種子引發(fā)(Seed priming)是一種基于種子萌發(fā)的生物學(xué)技術(shù)手段[1]，由Heydecker于1973年最早提出[2]，經(jīng)由特定預(yù)處理方法使種子緩慢吸水，確保種子萌發(fā)的代謝活動(dòng)順利進(jìn)行，進(jìn)而提升種子活力，其目標(biāo)是提高種子的萌發(fā)率，并且能增加萌發(fā)穩(wěn)定率和萌發(fā)整齊度，進(jìn)而增加苗的抗性并改良營養(yǎng)狀況。近年來，種子引發(fā)相關(guān)技術(shù)對(duì)植物的大量研究成果已在農(nóng)業(yè)貿(mào)易生產(chǎn)上取得成功運(yùn)用[3-4]。

常見的引發(fā)方法有水引發(fā)[5-6]，無機(jī)鹽引發(fā)如KCl和CaCl2[7]，有機(jī)物引發(fā)如PEG 6000[8]，甚至是納米材料如納米銀(Silver nanopaticale，AgNPs)[9]等，引發(fā)技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于小麥[7,10]、玉米[3]、水稻[8,11]、番茄[12]、豆類[13]及煙草[14]等作物。如，水引發(fā)處理水稻種子可以使萌發(fā)時(shí)間縮短26.8 h，苗高增加為對(duì)照的1.2倍，干質(zhì)量增加至對(duì)照的1.3倍[11]。盡管引發(fā)作為一項(xiàng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)被廣泛使用，但機(jī)理研究并不深入。一般認(rèn)為水引發(fā)或適度的滲透溶液引發(fā)可使種子通過了類似的“逆境鍛煉”[15]，給予種子更充分的機(jī)會(huì)修復(fù)細(xì)胞膜，提高種子的淀粉酶活力[9]，促進(jìn)種子代謝，提高種子的保護(hù)酶活性[8]，促進(jìn)DNA修復(fù)[16]，增加水孔蛋白表達(dá)[17]等。但上述研究未能解釋為什么適度的滲透溶液引發(fā)的效果優(yōu)于純水引發(fā)，是否在純水中引發(fā)時(shí)吸水過快會(huì)造成細(xì)胞原生質(zhì)膜的機(jī)械損傷，適度滲透溶液引發(fā)處理是促進(jìn)膜修復(fù)還是減輕快速吸水造成的機(jī)械損傷等問題。

本研究切入點(diǎn)為確定小麥種子最佳的引發(fā)條件，從引發(fā)過程中小麥種子物理與生理生化兩個(gè)方面的變化去揭示引發(fā)的機(jī)制，以揭示為什么輕微滲透脅迫的引發(fā)處理優(yōu)于純水或高滲透溶液，進(jìn)一步揭示引發(fā)的機(jī)制，為科學(xué)利用引發(fā)技術(shù)提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以小麥品種‘小偃22’(TriticumaestivumL.)的陳種子(購于2015年)為材料，以NaCl(分析純，西安化學(xué)試劑廠)為引發(fā)劑。選用陳種子作為材料是因?yàn)槠涓芊从骋l(fā)的效果[18]。經(jīng)TTC法測(cè)定，種子活力為(81.0± 3.35)%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 引發(fā)效應(yīng)的確認(rèn) 分別以純水(0 MPa)和水勢(shì)為-0.1、-0.3、-0.5、-0.7、-0.9、 -1.2 MPa NaCl溶液引發(fā)處理小麥種子，以證明引發(fā)現(xiàn)象存在并確定最佳的引發(fā)條件。小麥種子經(jīng)75%酒精消毒，置于室溫(15.5±2.0)℃下，在相應(yīng)的NaCl溶液中避光浸泡12 h，取出后拭干水分并避光風(fēng)干24 h作為引發(fā)處理，然后進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。萌發(fā)試驗(yàn)取引發(fā)處理后的種子各50粒，置于鋪有2層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，加無菌水5 mL，在(20.5±2.0)℃恒溫培養(yǎng)箱(KRC-100CL，上海齊欣科學(xué)儀器公司)中避光培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)充無菌水5 mL并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽粒數(shù)，以胚根突破種皮，長度為0.5 cm時(shí)為萌發(fā)，發(fā)芽種子移出培養(yǎng)皿。連續(xù)7 d無種子萌發(fā)時(shí)終止萌發(fā)試驗(yàn)。每個(gè)處理5次重復(fù)(共250粒)。以經(jīng)過活力調(diào)整的萌發(fā)率為萌發(fā)指標(biāo)：G=Ng/(Nt·Vi)×100%

式中：G為萌發(fā)率(%)；Ng為試驗(yàn)期內(nèi)累計(jì)萌發(fā)種子數(shù)；Nt為每個(gè)培養(yǎng)皿中供試種子數(shù)；Vi為TTC法測(cè)定的小麥種子活力。

1.2.2 NaCl引發(fā)的生理機(jī)制 (1)建立吸水曲線：取未經(jīng)引發(fā)的干種子、經(jīng)純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子分別放入5個(gè)培養(yǎng)皿中，加5 mL純水(每皿50粒，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)共250)，置于(20.5±2.0)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、36、48、72和96 h稱量，記錄質(zhì)量，稱量前拭干水分，稱量后放回培養(yǎng)皿。以相對(duì)質(zhì)量(吸水后質(zhì)量÷吸水前的初始質(zhì)量)對(duì)吸水時(shí)間作圖。

(2)生理指標(biāo)測(cè)定：種子細(xì)胞膜相對(duì)透性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白、α-淀粉酶活性及總淀粉酶活性等生理指標(biāo)測(cè)定參考高俊鳳[19]主編的《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。以未經(jīng)引發(fā)的種子作為對(duì)照，以0、-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)的種子(風(fēng)干24 h后)為處理測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。測(cè)定設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25粒。

(3)對(duì)比KCl引發(fā)：將經(jīng)純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子與經(jīng) -0.3及-0.7 MPa KCl溶液引發(fā)處理的種子分別放入5個(gè)培養(yǎng)皿中(每皿50粒，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)共250)，加5 mL純水，置于(20.5±2.0)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)充無菌水5 mL并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽粒數(shù)，記錄萌發(fā)進(jìn)程，以初步探究K+、Na+對(duì)引發(fā)產(chǎn)生的不同效應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對(duì)數(shù)據(jù)分析并作圖，并利用Chapman 3-parameter模型對(duì)萌發(fā)曲線進(jìn)行擬合，計(jì)算萌發(fā)率達(dá)到50%所需要的時(shí)間 t50，以及萌發(fā)率達(dá)到5%所需要時(shí)間 t5 (因?yàn)樵囼?yàn)每個(gè)重復(fù)為50粒，故以有2粒以上種子萌發(fā)時(shí)刻作為萌發(fā)的啟動(dòng)時(shí)間)。利用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。文中數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，插圖中的誤差棒均為標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 低濃度NaCl引發(fā)處理下小麥種子萌發(fā)情況

不同水勢(shì)的NaCl溶液引發(fā)處理對(duì)小麥種子萌發(fā)率的影響有顯著差異(圖1)。最終萌發(fā)率(吸水192 h)在-0.3 MPa處理下最高，為 (89.2±3.9)%，0～-0.3 MPa之間隨著水勢(shì)下降而升高，而-0.3～-1.2 MPa則隨水勢(shì)降低而降低，在-0.7 MPa萌發(fā)率開始低于50%。因此，后續(xù)試驗(yàn)中以純水，-0.3 MPa(最佳)和 -0.7 MPa(<50%)的NaCl溶液引發(fā)處理種子進(jìn)行研究，以未引發(fā)的干種子為對(duì)照(CK)。

從萌發(fā)的進(jìn)程看，純水引發(fā)處理的種子萌發(fā)啟動(dòng)時(shí)間(萌發(fā)率5%)較-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液處理的種子分別早2.47和22.67 h，萌發(fā)率達(dá)到50%所需時(shí)間比-0.3 MPa NaCl溶液處理早4.05 h，但萌發(fā)率在120 h后開始低于 -0.3 MPa引發(fā)處理的種子直至試驗(yàn)結(jié)束。而 -0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子最終萌發(fā)率低于50%，且萌發(fā)啟動(dòng)遲緩。

2.2 NaCl引發(fā)處理對(duì)小麥種子吸水過程的影響

試驗(yàn)中種子吸水過程依據(jù)吸水速率可分為快、慢、快3個(gè)時(shí)期，第一個(gè)時(shí)期為0～24 h，吸水曲線平均斜率為(1.62±0.28)×10-2(表1)；第二個(gè)時(shí)期為24～72 h，斜率為(0.76±0.11) ×10-2；第三個(gè)時(shí)期為72～96 h，斜率為(1.21± 0.02) ×10-2。在吸水初期(0～24 h)，與未經(jīng)引發(fā)處理的種子相比，無論是純水還是-0.3和 -0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理，其吸水速率均較低(圖2)。但24和48 h后，純水和-0.3 MPa引發(fā)處理的種子吸水速率先后超過未引發(fā)的種子，而-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子吸水速率全程處于最低水平。與純水引發(fā)相比，-0.3 MPa引發(fā)處理的種子吸水初期吸水速率較低，但24 h后二者相近，但吸水量后者始終低于前者。經(jīng)純水、-0.3和-0.7 MPa引發(fā)處的種子到達(dá)相對(duì)質(zhì)量150%所用時(shí)間分別為23.6、37.6和53.8 h。

實(shí)線為不同水勢(shì)溶液中種子萌發(fā)過程的擬合曲線，不同的點(diǎn)為實(shí)測(cè)值

Solid line in the figure is the fitting curve of seed germination process in different water potential solutions.The different points are measured values

圖1 低濃度NaCl引發(fā)處理小麥種子的萌發(fā)率
Fig.1 Promotion of wheat seed germination under treatment of hypoosmotic NaCl priming

表1 不同引發(fā)條件小麥種子吸水速率(斜率)變化Table 1 Changes in water absorption (slope ) of wheat seeds during different germination periods under different priming conditions

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).Duncan’s法多重比較。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference in table(P<0.05).Duncan’s method multiple comparison.The same below.

虛線表示相對(duì)質(zhì)量為150%

Dotted line indicates relative mass of 150%

圖2 不同引發(fā)處理的小麥種子吸水過程
Fig.2 Water absorption process of wheat seeds under different priming treatments

2.3 適度NaCl引發(fā)處理對(duì)小麥種子膜完整性的影響

經(jīng)-0.3 MPa NaCl溶液處理的種子其MDA質(zhì)量摩爾濃度(圖3-A)和相對(duì)電導(dǎo)率(圖3-B)均顯著低于其他處理，而經(jīng)-0.7 MPa 處理的種子其MDA質(zhì)量摩爾濃度與未經(jīng)處理和純水引發(fā)的種子差異不顯著，但相對(duì)電導(dǎo)率顯增加，表明純水對(duì)萌發(fā)中的種子的傷害可能更多地來源于機(jī)械損傷，如膜撕裂，而不是化學(xué)因素造成的傷害。同理，與-0.3 MPa NaCl溶液處理相比，未引發(fā)種子和純水引發(fā)后的種子中MDA質(zhì)量摩爾濃度和相對(duì)電導(dǎo)率均上升，且未引發(fā)種子的細(xì)胞膜相對(duì)透性顯著高于-0.3 MPa NaCl溶液處理，同樣表明種子在純水中萌發(fā)會(huì)傷害細(xì)胞膜，且主要是機(jī)械傷害。

2.4 NaCl引發(fā)處理對(duì)小麥種子可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

與未經(jīng)引發(fā)的種子相比，經(jīng)過引發(fā)后的種子其可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(圖3-C)。經(jīng) -0.3 MPa NaCl溶液處理后其可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于未經(jīng)引發(fā)的種子和純水引發(fā)的種子，高于-0.7 MPa處理，但差異不顯著。但同樣處理的種子由另一獨(dú)立小組測(cè)定的結(jié)果與本試驗(yàn)中結(jié)果有相同變化趨勢(shì)(結(jié)果未公開)，因此，-0.3 MPa NaCl溶液處理后可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于-0.7 MPa處理的結(jié)果也是肯定的。分析萌發(fā)數(shù)據(jù)，可以推定這些增加的可溶性蛋白更多的是與萌發(fā)相關(guān)的功能性蛋白，而不是類似于 -0.7 MPa處理后脅迫蛋白。究竟是哪些相關(guān)蛋白增加，有待于通過蛋白組學(xué)研究來揭示。

圖中柱上不同小寫字母表示處理間差異達(dá)5%顯著水平

Different lower-case letters indicate statistically significant difference under different treatments (P<0.05)

圖3 不同引發(fā)條件下小麥種子的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(A)、相對(duì)電導(dǎo)率(B)、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)
Fig.3 Malondialdehyde molality，relative electrical conductivity and soluble protein fraction in wheat seeds under different priming conditions

2.5 NaCl引發(fā)處理對(duì)小麥種子淀粉酶活力的影響

萌發(fā)過程中，種子中的α-淀粉酶活性(圖4-A)和總淀粉酶活性(α-淀粉酶和β-淀粉酶活性之和)(圖4-B)均隨萌發(fā)時(shí)間的延續(xù)而增加。萌發(fā)率與同期α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關(guān)性分別為0.73和0.74，而與前24 h α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關(guān)性分別為0.75和0.77。表明萌發(fā)率與淀粉酶活性相關(guān)，但更多地受萌發(fā)前的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性。成對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，純水引發(fā)與未經(jīng)引發(fā)種子的α-淀粉酶活性差異不顯著，但總淀粉酶活性的差異達(dá)到極顯著水平。表明純水引發(fā)主要是提高了β-淀粉酶活性，而非α-淀粉酶活性。-0.3 MPa引發(fā)處理的種子的α-淀粉酶顯著高于其他處理，但總淀粉酶活性與純水處理間無差異。表明適當(dāng)鹽脅迫處理可以提高α-淀粉酶活性，促進(jìn)萌發(fā)。而-0.7 MPa引發(fā)處理的種子的α-淀粉酶和總淀粉酶活性均較低，這可能是萌發(fā)率低的原因之一。

圖4 引發(fā)后的小麥種子的淀粉酶活性在萌發(fā)過程中淀粉酶活性的變化Fig.4 Amylase activity of wheat seeds during germination of seeds after different priming conditions

2.6 NaCl和KCl分別引發(fā)處理對(duì)小麥種子萌發(fā)進(jìn)程的影響

為進(jìn)一步確認(rèn)-0.3 MPa NaCl溶液處理可提高小麥種子萌發(fā)率的原因，對(duì)同為-0.3 MPa 的NaCl和KCl溶液的引發(fā)效果進(jìn)行比較，結(jié)果(圖5)顯示，2種鹽溶液都在-0.3 MPa引發(fā)處理下最終萌發(fā)率最高，但是從整個(gè)萌發(fā)過程來看，-0.3 MPa KCl引發(fā)處理的種子在萌發(fā)初期即表現(xiàn)出相對(duì)較好的萌發(fā)活力，且最高萌發(fā)率大于純水處理，而-0.3 MPa NaCl引發(fā)處理的種子是在中后期萌發(fā)率超過純水處理，達(dá)到最高萌發(fā)率相對(duì)較晚。這表明引發(fā)處理不僅是水勢(shì)降低的效果(滲透脅迫)，也會(huì)受引發(fā)劑性質(zhì)的影響，本試驗(yàn)中K+效果會(huì)優(yōu)于Na+。

表2 不同引發(fā)處理對(duì)淀粉酶活性影響的顯著性對(duì)比Table 2 Significant comparison of effects of different priming treatments on amylase activity

注：**：差異極顯著(P≤0.01)，*：差異顯著(0.01

Note：**:Extremely significant(P≤0.01), *:Significant(0.01

圖5 NaCl和KCl分別引發(fā)處理的小麥種子萌發(fā)進(jìn)程Fig.5 Germination processes of wheat seeds primed by NaCl and KCl

3 討 論

本研究中，經(jīng)不同水勢(shì)NaCl溶液處理后的小麥種子最終萌發(fā)率存在顯著差異，適度的低水勢(shì)溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發(fā)率最高，確認(rèn)了引發(fā)現(xiàn)象的存在。但與純水處理的種子相比，萌發(fā)啟動(dòng)晚(圖1)。其他研究也表明這種適度的低水勢(shì)溶液處理種子萌發(fā)率高，而且后期出苗整齊，抗性增強(qiáng)[9,20]，這也正是種子引發(fā)技術(shù)在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用的原因。但適度的低水勢(shì)溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發(fā)啟動(dòng)晚，但后期萌發(fā)速率快的現(xiàn)象未見報(bào)道。

引發(fā)處理可以改善種子的吸水量進(jìn)而影響種子的萌發(fā)率[21]，干種子內(nèi)部襯質(zhì)勢(shì)較高，吸脹速率過快，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害[6]，引發(fā)處理被認(rèn)為可以緩解這種損傷，并有利于膜系統(tǒng)修復(fù)[22]。細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化可導(dǎo)致MDA質(zhì)量摩爾濃度的上升，并進(jìn)一步傷害膜[23]，若膜損傷以機(jī)械撕裂為主，則透性增加會(huì)更為突出。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)引發(fā)處理的種子相比，純水和 -0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子吸水速率在24和48 h后分別超過未經(jīng)引發(fā)處理的種子，這可能與吸水初期較慢的吸水速率使得使膜受到較少傷害或得到一定修復(fù)，并增加水孔蛋白表達(dá)有關(guān)。由于純水和-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)的種子中MDA質(zhì)量摩爾濃度(圖3-A)和細(xì)胞膜相對(duì)透性(圖3-B)均低于未經(jīng)引發(fā)處理的種子。純水引發(fā)與-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)相比，后者吸水速率(表1)和吸水量均低于前者(圖2)，萌發(fā)啟動(dòng)晚(圖1)，但最終萌發(fā)率最高。表明吸水多并不一定萌發(fā)率高。而且純水引發(fā)的種子不僅是細(xì)胞膜相對(duì)透性增加，且MDA產(chǎn)生量較 -0.3 MPa引發(fā)處理后的種子更高，說明-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)處理后種子的膜破壞性最小或修復(fù)得更好。這與部分學(xué)者的研究相吻合，肖雪峰等[24]的研究發(fā)現(xiàn)PEG能通過滲透作用有效改善植物細(xì)胞膜的滲透勢(shì)，控制種子萌發(fā)時(shí)水分的進(jìn)入，有效降低或消除種子吸水過快的情況，使種子有足夠時(shí)間完成生物膜的修復(fù)。

α-淀粉酶是小麥中淀粉水解的關(guān)鍵酶，直接關(guān)系到幼苗的建成[25]。本研究也表明，經(jīng)過引發(fā)后種子中可溶性蛋白增加(圖3-C)，淀粉酶活性增強(qiáng)，萌發(fā)率與淀粉酶活性相關(guān)，但更多地受萌發(fā)前(引發(fā)后)的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性，且-0.3 MPa引發(fā)處理可以提高α-淀粉酶活性并間接促進(jìn)了β-淀粉酶在萌發(fā)過程中的生成，進(jìn)而促進(jìn)萌發(fā)。α-淀粉酶活性的增加，可能會(huì)增加更多的可溶性糖，進(jìn)而增加種子內(nèi)外水勢(shì)差，增加吸水速率。但實(shí)際結(jié)果是-0.3 MPa NaCl引發(fā)與純水引發(fā)相比，吸水速率和吸水量均較低。因此，淀粉水解后的糖可能更多地被呼吸利用或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，而不是作為溶質(zhì)降低水勢(shì)來增加吸水動(dòng)力。

鉀元素為小麥必需的大量礦質(zhì)元素，而鈉元素僅為有益元素，分別以同樣摩爾濃度的NaCl和KCl溶液處理小麥種子，檢測(cè)對(duì)萌發(fā)過程的影響，有利于區(qū)分Na+和K+的生理效應(yīng)。盡管有關(guān)于不同引發(fā)劑效應(yīng)的研究[22]顯示了不同化合物之間引發(fā)處理結(jié)果上的差異，但以往的研究沒有去區(qū)別不同離子的效應(yīng)。本研究結(jié)果表明引發(fā)處理不僅是水勢(shì)降低的效果(滲透脅迫)，也會(huì)受離子差異的影響，本例中K+效果優(yōu)于Na+，即使是-0.7 MPa處理下，K+效果也優(yōu)于Na+，但原因尚不清楚。

綜上所述，NaCl適度脅迫引發(fā)(-0.3 MPa)和純水引發(fā)均可以提高小麥種子萌發(fā)率，未經(jīng)引發(fā)和純水引發(fā)的種子在吸水過程中快速吸水傷害細(xì)胞膜，而-0.3 MPa NaCl引發(fā)處理則減少了細(xì)胞膜所受的傷害，提高淀粉酶，尤其是α-淀粉酶活性促進(jìn)萌發(fā)。這種萌發(fā)率的提高，不是通過增加吸水速率或吸水量實(shí)現(xiàn)的。未來研究中，應(yīng)注意引發(fā)處理的種子在萌發(fā)過程中不同時(shí)刻的物質(zhì)變化。