徐登峰，余遠(yuǎn)迪，張素輝，付利芝，許國洋，趙揚(yáng)揚(yáng)，沈克飛

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes)是革蘭氏陽性細(xì)菌，是山羊化膿性肺炎的主要病原之一，感染導(dǎo)致肺臟組織不可逆損傷，嚴(yán)重影響羔羊的存活率[1-2]?；撾[秘桿菌是革蘭氏陽性菌，主要寄生在動物的呼吸道、消化道、生殖道等黏膜，屬于一種共生性條件致病菌，通常導(dǎo)致多種動物的肺臟膿腫、肝膿腫、腦膿腫、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、流產(chǎn)和死胎等[3-5]。

在哺乳動物體內(nèi)，游離鐵含量極低，細(xì)胞外的鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)的鐵與血紅蛋白等蛋白質(zhì)有關(guān)的血紅素結(jié)合。獲取鐵的能力是許多致病菌致病的必要條件，致病菌需要利用自身表達(dá)的ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體等系統(tǒng)從宿主體內(nèi)攝取鐵，以抵御宿主的殺菌作用，維持生存和毒力[6-7]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體由ABC型膜透酶(Permease)、ATP結(jié)合蛋白質(zhì)(或稱ATP酶，ATPase)和底物結(jié)合蛋白(Substrate-binding protein，SBP)組成，不同類型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)不同的底物。在ABC系統(tǒng)中，底物首先被SBP結(jié)合，然后通過ATP驅(qū)動的滲透作用穿過膜。SBP在革蘭氏陰性菌中定位于周質(zhì)空間，在革蘭氏陽性菌中定位于細(xì)胞膜。SBP是一類細(xì)菌黏附蛋白，其中一部分是致病菌的毒力因子，在細(xì)菌體內(nèi)的生存過程中和致病過程中發(fā)揮重要作用，同時也是疫苗候選抗原[8]。山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH基因組中注釋的編碼鐵攝取的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體主要有：二價(jià)金屬離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、血紅素(Heme)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，在化膿隱秘桿菌不同菌株中高度保守，功能可能類似于其他病原菌的鐵攝取相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，在宿主體內(nèi)不同鐵環(huán)境條件下會出現(xiàn)差異表達(dá)，以適應(yīng)攝取宿主體內(nèi)不同組織的鐵源[9-10]。

化膿隱秘桿菌已鑒定的毒力因子有溶血素(Pyolysin，PLO)和黏附蛋白膠原結(jié)合蛋白(Collage-binding protein，Cbp)CbpA、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidases，Nan)Nan H和Nan P等[11-15]，除了PLO，至今還沒有發(fā)現(xiàn)新的保護(hù)性抗原。這阻礙了用于化膿隱秘桿菌感染的預(yù)防、診斷和控制所需新產(chǎn)品、新方法和新技術(shù)的研發(fā)，也不利于開展化膿隱秘桿菌免疫應(yīng)答機(jī)制的研究。為此，本研究應(yīng)用免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)鑒定膜相關(guān)的化膿隱秘桿菌候選抗原，進(jìn)而開展候選抗原的抗原性、免疫原性和免疫保護(hù)效果研究，為化膿隱秘桿菌亞單位疫苗研究提供新的可選抗原。

1 材料與方法

1.1 菌株、抗血清及質(zhì)粒

山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株 2012CQ-ZSH 及其小鼠抗血清由重慶畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存和提供；大腸桿菌BL21(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司；pGEX-4T-1質(zhì)粒購自北京沃比森科技有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)菌膜蛋白分離試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司；還原性谷胱甘肽購自GE Healthcare公司；GST小鼠單克隆抗體(GST2)、堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(完整分子)抗體購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司，Gluthathione-Sepharose 4B購自GE Healthcare生物科學(xué)有限公司；BCTP/NBT購自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker、pMD18-T載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

體質(zhì)量約為25 g的雌性SPF昆明小鼠購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)，分為GST融合蛋白免疫組、GST免疫組和PBS對照組，每組15只。

1.4 膜蛋白分離提取

使用細(xì)菌膜蛋白分離試劑盒分離提取新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌膜蛋白，具體操作按說明書要求進(jìn)行。采用SDS-PAGE檢測提取的膜蛋白，采用免疫印跡技術(shù)分析提取的膜蛋白與化膿隱秘桿菌免疫的小鼠血清的反應(yīng)原性。

1.5 質(zhì)譜與序列分析

切下與免疫血清反應(yīng)的聚丙烯酰胺凝膠上對應(yīng)的條帶，采用 LC-MS/MS 方法對樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。將獲得的多肽序列在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索以獲得靶標(biāo)蛋白的編碼基因。

1.6 基因克隆

以PCR方法從山羊化膿隱秘桿菌重慶分離株2012CQ-ZSH基因組(GenBank登錄號CP012649)中擴(kuò)增目的基因。上游引物序列為GGATCCTCCTCTAAGCCT，下游引物序列為CTCGAGTTACTTCAGGCCGGC，斜體部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。使用細(xì)菌 DNA 試劑盒提取化膿隱秘桿菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer (含15 mmol/L Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，5 U/μL rTaq0.10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，DNA 0.5 μL，用去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。目的片段經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α，進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌等步驟。經(jīng)序列測定正確的重組質(zhì)粒使用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，將酶切下的目的基因與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T-1連接構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-SBP，轉(zhuǎn)化入DH5α，篩選陽性克隆提取重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)菌株用于誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-SBP。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

37 ℃振搖培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)OD600≈1時，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 3 h。培養(yǎng)物 4 ℃ 5 000 r/min離心 30 min，沉淀用 PBS 洗滌 3 次。每 100 mL培養(yǎng)液加 20 mL PBS 以懸浮菌體沉淀，冰水浴中超聲裂解菌懸液(超聲功率為 300 W，工作 4 s 間歇 5 s，超聲裂解 15 min)。裂解物 12 000 r/min 離心 10 min，樣本經(jīng) SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用 50 g/L 脫脂奶粉封閉 2 h，TBST洗 3 次后與 GST 單克隆抗體(1∶5 000)孵育，TBST 洗 3 次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG (1∶5 000)孵育，最后置 BCTP/NBT 中顯色。

1.8 重組蛋白質(zhì)純化

向裂解物中加入體積分?jǐn)?shù)為1%的 Trition X-100，4 ℃振搖孵育 30 min，5 000 r/min 離心 30 min，收集上清。每 20 mL上清加入 300 μL Gluthathione-Sepharose 4B，4 ℃攪動孵育 1 h。PBS 洗滌 3 次后用 10 mmol/L 還原性谷胱甘肽洗脫，采用 SDS-PAGE 分析純化效果。

1.9 重組蛋白與抗血清反應(yīng)

將純化的GST-SBP轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用 50 g/L的脫脂奶粉封閉 2 h，TBST 洗 3 次后與化膿隱秘桿菌小鼠抗血清(1∶500)孵育，TBST 洗 3 次后與堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(1∶5 000)孵育，最后置 BCTP/NBT中 顯色。

1.10 重組蛋白質(zhì)的免疫原性及保護(hù)作用

將純化的重組蛋白和鋁膠佐劑按體積比 5∶1混合，充分搖勻，每只小鼠腿部肌肉注射0.2 mL，蛋白劑量為10 μg，間隔2周免疫1次，共免疫3 次。GST-SBP免疫15 只小鼠，GST免疫15 只小鼠。對照組小鼠15 只，每只肌肉注射PBS 0.2 mL。第3次免疫15 d后，采集眶前靜脈血液，每組采集5 只，分離血清。采用已純化的GST-SBP為包被抗原的間接ELISA方法測試特異性抗體水平，每份血清做3次平行檢測，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用免疫印跡分析GST-SBP免疫小鼠血清與化膿隱秘桿菌菌體蛋白的識別反應(yīng)。剩下的10只小鼠用于攻毒以測試保護(hù)率。采用已進(jìn)行平板計(jì)數(shù)的新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌進(jìn)行攻毒，每只小鼠腹腔注射細(xì)菌劑量為1×109個CFU(菌落形成單位)。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜蛋白提取與質(zhì)譜分析

利用細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒從新鮮培養(yǎng)的化膿隱秘桿菌菌體中提取膜蛋白，SDS-PAGE顯示所提取的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為35～140 ku(圖1)，免疫印跡顯示所提取的膜蛋白能與化膿隱秘桿菌免疫的小鼠血清發(fā)生反應(yīng)，呈現(xiàn) 2 條特異條帶，分子質(zhì)量分別約為68 ku和40 ku(圖2)。將對應(yīng)SDS-PAGE凝膠上的2條蛋白質(zhì)條帶切下進(jìn)行LC-MS/MS分析，獲得2條多肽序列：VLVTGHDAFNYLGR和IADTELFADTLGTEAPVDTYVGAFK，得分為229。BLAST搜索結(jié)果顯示，這2條多肽序列與化膿隱秘桿菌鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體SBP高度同源，同時該SBP在不同化膿隱秘桿菌分離株中的同源性高于99%。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.膜蛋白

M.Protein marker；1.Membrane proteins

圖1 提取的膜蛋白電泳圖 Fig.1 Electrophoresis of membrane protein

2.2 基因克隆

運(yùn)用PCR技術(shù)從化膿隱秘桿菌基因組中擴(kuò)增到與預(yù)期大小888 bp相符的目的基因SBP(圖3)，序列測定結(jié)果顯示所得基因序列無突變。利用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶從重組質(zhì)粒pMD18-T-SBP中酶切獲得SBP基因，將其克隆至質(zhì)粒pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)。篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，采用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒，獲得與目的基因大小相符的片段(圖4)，表明成功構(gòu)建含SBP基因的重組質(zhì)粒和重組菌株。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未免疫小鼠血清；2.免疫小鼠血清

M.Protein marker；1.Serum of unimmunized mice；2.Serum of immunized mice

圖2 提取的膜蛋白與化膿隱秘桿菌
免疫小鼠血清的反應(yīng)(免疫印跡)
Fig.2 Response of extracted membrane proteins to mouse serum immunized with
T.pyogenes(Western blot)

M.DNA marker DL2000；1.PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA marker DL2000；1.PCR products；2.Negative control

圖3 目的基因的PCR擴(kuò)增
Fig.3 PCR amplification of target gene

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

免疫印跡分析顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在誘導(dǎo)培養(yǎng)物裂解液上清中可見分子質(zhì)量約58 ku的目的條帶，大小與預(yù)期相符，表明融合蛋白GST-SBP在重組大腸桿菌BL21(DE3)以可溶性形式表達(dá)(圖5)。

M.DNA marker DL2000；1.酶切的重組質(zhì)粒pGEX-SBP； 2.未酶切的重組質(zhì)粒pGEX-SBP

M.DNA marker DL2000；1.Enzyme-digested recombinant plasmid pGEX-SBP；2.Undigested recombinant plasmid pGEX-SBP

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
Fig.4 Recombinant plasmid identification

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)培養(yǎng)物裂解液上清；2.誘導(dǎo)培養(yǎng)物裂解液上清

M.Protein marker；1.Uninduced culture lysate supernatant；2.Induced culture lysate supernatant

圖5 Western blot分析重組表達(dá)的GST-SBP
Fig.5 Expression analysis of GST-SBP

2.4 重組蛋白純化

利用Gluthathione-Sepharose 4B從重組菌BL21(DE3)誘導(dǎo)培養(yǎng)物裂解液上清中純化到重組蛋白GST-SBP，經(jīng)測試純度高于95%，每100 mL培養(yǎng)物可獲得10 mg純化的SBP (圖6)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GST-SBP

M.Protein marker;；1. GST-SBP

圖6 GST-SBP的純化
Fig.6 Purified GST-SBP

2.5 GST-SBP與抗血清的反應(yīng)

免疫印跡結(jié)果顯示(圖7)，純化的GST-SBP與化膿隱秘桿菌免疫的小鼠抗血清能發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，呈現(xiàn)一條與GST-SBP大小一致的特異條帶，表明重組表達(dá)的GST-SBP具有反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.化膿隱秘桿菌免疫的小鼠血清；2.未免疫小鼠血清

M.Protein marker；1.Serum of mice immunized withT.pyogenes；2.Serum of mice unmmunized

圖7 GST-SBP與化膿隱秘桿菌
免疫小鼠血清的免疫印跡分析
Fig.7 Immunoblotting analysis of GST-SBP and antiserum

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.GST-SBP免疫的小鼠血清；2.GST免疫的小鼠血清

M.Protein marker；1.Serum of mice immunized with GST-SBP；2.Serum of mice immunized with GST

圖8 GST-SBP抗血清與化膿隱秘桿菌
菌體蛋白的免疫印跡分析
Fig.8 Immunoblotting analysis of GST-SBP antiserum andT.pyogenesproteins

2.6 GST-SBP的免疫保護(hù)作用

經(jīng)測試分析，GST-SBP免疫的小鼠產(chǎn)生高水平的抗體(表1)，抗體能識別化膿隱秘桿菌菌體蛋白，產(chǎn)生1條特異性條帶，條帶大小與化膿隱秘桿菌小鼠抗血清同化膿隱秘桿菌反應(yīng)出現(xiàn)的條帶大小一致(圖8)。結(jié)果表明SBP具有免疫原性。在1×109化膿隱秘桿菌腹腔攻毒后，PBS對照組 10只小鼠全部死亡，GST免疫組死亡9只，GST-SBP免疫小鼠死亡1 只，存活9 只，保護(hù)率為90%，表明SBP有免疫保護(hù)作用。

表1 免疫小鼠抗體水平Table 1 Antibody level in immunized mice

3 討 論

膜蛋白是病原菌膜結(jié)構(gòu)的主要組分，不僅在病原菌的生命活動中具有重要的生理功能，且部分膜蛋白還與病原菌的感染及刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答密切相關(guān)[16-17]。為了鑒定化膿隱秘桿菌的新候選抗原，本研究提取化膿隱秘桿菌膜蛋白，運(yùn)用免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)鑒定出2條與化膿隱秘桿菌鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的SBP匹配的多肽序列。免疫印跡結(jié)果顯示，該SBP的重組蛋白GST-SBP能與化膿隱秘桿菌抗血清發(fā)生特異反應(yīng)，GST-SBP抗血清能與化膿隱秘桿菌菌體蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明SBP具有抗原性和免疫原性，同時佐證質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可靠性。

近年來，細(xì)菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體作為疫苗候選抗原受到關(guān)注[18-19]。肺炎鏈球菌表面蛋白PsaA(錳和鋅離子ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體SBP)是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)定植咽部的黏附蛋白，以殼聚糖為輸送系統(tǒng)，PsaA能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答及系統(tǒng)免疫應(yīng)答，增加對肺炎球菌急性中耳炎和侵襲性感染的保護(hù)[20]。Semchenko等[21]證實(shí)淋病奈瑟菌的MetQ(甲硫氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合蛋白)能黏附宮頸上皮細(xì)胞，MetQ突變株在人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血清中存活率下降，并能夠阻止菌體黏附上皮細(xì)胞。卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，是兒童中耳炎和成人下呼吸道慢性阻塞性肺病的致病菌)的AfeA(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體SBP)誘導(dǎo)了小鼠肺部抗卡他莫拉菌的保護(hù)性免疫[22]。伍小松等[23]用豬多殺性巴氏桿菌重組抗菌肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP 酶免疫小鼠，相比于對照組，提高了免疫組小鼠攻毒后的存活率。細(xì)菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體透酶也是重要的候選抗原[24]。本研究結(jié)果顯示，免疫鐵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體重組SBP的小鼠能抵御致死劑量的化膿隱秘桿菌攻擊，免疫小鼠存活率為90%，表明該SBP是免疫原性良好的保護(hù)性抗原，可用于化膿隱秘桿菌亞單位疫苗的研發(fā)。