李全勝，孫國清，梁 飛，王國棟，謝宗銘，陳 云

(1.新疆農墾科學院 農田水利與土壤肥料研究所，新疆石河子 832000；2.中國農業(yè)科學院 生物技術研究所，北京100081；3.新疆農墾科學院 生物技術研究所/作物種質創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832000)

由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae Kleb.)引起的棉花黃萎病是新疆棉花生產(chǎn)上最具破壞性的土傳病害之一[1]，并且隨著耕作年限的延長，其危害性還在不斷擴大和加重。目前生產(chǎn)中防治方法主要包括培育抗性品種、輪作倒茬、化學防治和生物防治[2-3]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和農業(yè)部“減肥減藥”行動的實施，以生物防治為主導的綠色綜合防控技術逐步走進農業(yè)生產(chǎn)中，并廣受群眾的信賴和喜愛[4]。針對土傳病害的生物防治主要就是利用自然界中的有益微生物來防治各種病原微生物，其中在棉花黃萎病防治上應用較多的是芽孢桿菌、假單胞菌和木霉等[5-7]。隨著生防菌菌種商業(yè)化開發(fā)技術的逐漸成熟，各類生防菌劑已經(jīng)應用到農田和溫室大棚，并在作物病害防治方面取得了一定的防效[8]。

細菌是農田土壤中含量最多的微生物類群，其在土壤碳、氮循環(huán)和營養(yǎng)物質轉化方面發(fā)揮著重要的作用，土壤細菌群落多樣性及豐富度同作物生長發(fā)育及土傳病害防治密切相關[9]。生物防治過程中會有大量的生防微生物被引入到農田中，這種外來生物的入侵勢必會對農田中原有微生物群落結構帶來影響。因此，有必要開展生防細菌對土壤微生態(tài)影響的評價。早期研究微生物群落多樣性的方法主要有平板培養(yǎng)計數(shù)、微生物生物量測定法、Biolog碳素利用和磷脂脂肪酸PLFA等傳統(tǒng)分析方法以及RAPD和PCR-DGGE等分子生物學分析方法，但這些方法存在通量低、操作復雜、周期長、痕量微生物檢測困難等弊端[10]。近年來發(fā)展的高通量測序技術，具有通量高、周期短、分析深入等優(yōu)勢，成為當前微生物多樣性研究廣泛采用和認可的技術[11-12]。

IonS5TMXL測序平臺利用半導體芯片技術，將化學信號直接轉換為數(shù)字信號，不需要熒光激發(fā)和CCD掃描等環(huán)節(jié)，同454、Illumina測序平臺相比具有快速靈活、成本低的優(yōu)勢，為微生物多樣性研究提供更多的選擇[13]。莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)H14是農業(yè)微生物資源發(fā)掘及其應用科研團隊篩選獲得的1株對棉花黃萎病具有較好防效的生防細菌，后期通過發(fā)酵工藝優(yōu)化和菌劑配方研究，制備了1種水分散粒劑[4,14]。本研究以不施菌劑和施用商業(yè)菌劑作對照，采用IonS5TMXL測序平臺，分析水分散粒劑H14對土壤大麗輪枝菌數(shù)量和細菌多樣性的影響，以期為生防菌劑的田間施用提供理論指導和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地點設在新疆惠遠種業(yè)股份有限公司棉花黃萎病病圃地，該病圃地連續(xù)種植棉花10 a，屬黃萎病發(fā)病重病田。土壤類型為灰漠土，0～40 cm有機質質量分數(shù)平均為12.14 g/kg，堿解氮80.30 mg/kg，速效磷10.08 mg/kg，速效鉀 200.46 mg/kg，土壤pH 8.3。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試棉花品種 ‘新陸早36’由石河子棉花研究所選育，該品種具有早熟和豐產(chǎn)等特點。

1.2.2 供試菌劑 水分散粒劑H14(由作物種質創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室制備，功能菌為莫哈韋芽孢桿菌H14，芽孢含量≥ 2×109CFU/g)；商業(yè)可濕性粉劑(由河北農林科學院提供，功能菌為枯草芽孢桿菌，有效活菌數(shù)≥ 2×109CFU/g)。

1.3 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，設水分散粒劑H14灌根(H14)、商業(yè)可濕性粉劑灌根(SY)和清水灌根3個處理，且以清水灌根作對照(CK)。每種處理重復3次。2018-04-16播種，1膜6行，行距配置為寬窄行66 cm+10 cm，株距10 cm，小區(qū)面積10.25 m2(2.05 m×5.0 m)，共計9個小區(qū)。根據(jù)當?shù)攸S萎病的發(fā)病規(guī)律，分別在棉花苗期(5月8日)和蕾期(6月22日)灌根施用菌劑，每個生育期施用量為15 kg/hm2，共計30 kg/hm2。

1.4 樣品采集及病情調查

1.4.1 土樣采集 8月5日采集土樣，每個小區(qū)隨機選5株棉花，每株棉花取根圍土混勻，立即用無菌封口袋包扎密封，置于冰盒中帶回實驗室 -80 ℃保存，備用。

1.4.2 病情調查 8月5日進行棉花黃萎病發(fā)病狀況調查，發(fā)病程度標準參照呂寧等[15]方法分5級，經(jīng)過統(tǒng)計分析后計算黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，發(fā)病率=發(fā)病植株數(shù)/全部調查植株數(shù)×100%，病情指數(shù)=發(fā)病植株的總病級數(shù)/全部調查植株的理論最高總病級數(shù)。根圍土壤中大麗輪枝菌數(shù)量的相對豐度經(jīng)IonS5TMXL測序平臺通過高通量測序獲得。

1.5 細菌群落結構分析

1.5.1 16S rDNA PCR擴增 采用土壤基因組DNA提取試劑盒提取各樣品中土壤基因組總DNA，用無菌水將DNA濃度稀釋至1 ng/μL，作為PCR擴增模板，使用515F/806R引物擴增細菌16S rDNA V4區(qū)。PCR擴增體系：Phusion Master MiX(2×)15 μL，模板(1 ng/μL)10 μL，引物F(2 μmol/L)1.5 μL，引物R(2 μmol/L)1.5 μL，ddH2O 2 μL，總量30 μL。PCR循環(huán)梯度反應參數(shù)：98 ℃預變性1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，保持 4 ℃直到反應完成。

1.5.2 擴增產(chǎn)物測序 等質量混樣PCR擴增產(chǎn)物采用20 g/L瓊脂糖膠電泳純化，回收目的條帶，對目的條帶進行文庫構建和質檢，質檢合格的文庫采用IonS5TMXL進行測序，由北京康普森生物技術有限公司完成測序。

1.5.3 測序數(shù)據(jù)分析 采用Cutadapt(V1.9.1)軟件對測序數(shù)據(jù)進行質控、過濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse(V7.0.1001)軟件對優(yōu)質序列在97%相似度下進行聚類，得到可操作分類單元(OUT，operational taxonomic unit)的代表序列；采用Mothur(V1.25.0)軟件將OTU代表序列與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫比對，并進行物種注釋(閾值為0.8～1)。利用Qiime(V1.7.0)軟件計算豐富度指數(shù)Chao1和ACE，多樣性指數(shù)Simpson和Shannon[16-17]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進行整理，采用SPSS 17.0進行Duncan差異顯著性檢驗(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 棉花黃萎病發(fā)病狀況

由圖1可知，CK中棉花黃萎病發(fā)病率高達86.74%，病情指數(shù)為31.07，發(fā)病程度較為嚴重；而施用芽孢桿菌菌劑后，H14和SY處理中發(fā)病率分別顯著下降42.35%和39.25%，病情指數(shù)分別顯著下降52.41%和48.78%(圖1)。施用芽孢桿菌菌劑也著降低了根圍土壤中大麗輪枝菌的相對豐度，同對照相比，H14和SY處理中大麗輪枝菌相對豐度分別顯著下降45.73%和24.47%(圖1)，這同發(fā)病率和病情指數(shù)的變化趨勢一致。

圖1 不同處理棉花黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)和土壤中大麗輪枝菌豐度Fig.1 The disease incidence,disease index and relative abundance of Verticillium dahliae in different treatments

2.2 土壤細菌測序信息

采用IonS5TMXL測序平臺，對3組處理共計9個土壤樣品的細菌16S rDNA的高度變異區(qū)V4區(qū)進行測序，通過對原始序列整理和過濾后，9個樣品共獲得561 278條有效序列，其中優(yōu)質序列為517 453條，占有效序列92.19%，測序質量值(Q20)均大于88%，表明測序質量較高，測序數(shù)據(jù)準確有效(表1)。優(yōu)質序列長度分布在220～260 nt，且在253 nt分布最多，平均長度為252 nt，3組處理中有效序列和優(yōu)質序列最高的均為H14處理土壤樣品，有效率最高的是SY處理土壤 樣品。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)Table 1 Sequencing data of samples

2.3 細菌群落的豐富度和多樣性

每次隨機選取5 685條序列，采用累加的方法繪制各樣品的稀釋曲線(圖2)。隨著序列數(shù)量的增多各樣品中OTU數(shù)量迅速升高；當序列數(shù)量增多到28 435條時，各樣品的稀釋曲線均趨于平坦，表明樣品測序數(shù)量合理，能夠反映各樣品中細菌群落組成特征。

在97%的相似度下對樣品的有效序列進行聚類，共獲得OUT數(shù)目為24 353個。全部OTU可劃分為54個門、67個綱、135個目、244個科、571個屬。各樣品中OUT的數(shù)量為H14>SY>CK(表2)，但差異不顯著。利用Venn圖分析各樣品細菌群落OTU之間的關系，結果如圖3所示，3組樣品間共有細菌OTU數(shù)目為2 347個，代表的物種分別屬于變形菌門657個、放線菌門474個、綠彎菌門236個等，占總OUT的 68.85%；3組樣品各自特有細菌OTU數(shù)目為 1 062個，特有的OUT數(shù)目分別為425個、360個和277個，其中H14處理中土壤樣品特有的OUT數(shù)目最多。

Chao1和ACE指數(shù)可反映土壤細菌群落物種豐富度，由表2可知H14、SY處理土壤樣品細菌Chao1和ACE指數(shù)相較于CK處理分別增加16.27%和14.71%、13.84%和12.90%。Shannon和Simpson指數(shù)可反映土壤細菌群落物種多樣性，由表2可知H14、SY處理土壤樣品細菌Shannon和Simpson指數(shù)相較于CK處理分別增加了2.65%和1.02%、1.38%和0.00%。以上結果表明，施用芽孢桿菌菌劑不僅提高了土壤細菌群落物種的豐富度還增加了物種的多樣性，其中H14處理影響效果更為明顯。

根據(jù)皮爾森相關系數(shù)(表3)得出，大麗輪枝菌相對豐度與棉花黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)分別呈顯著正相關，正相關系數(shù)為分別為0.789和 0.787；而土壤細菌群落多樣性與棉花黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)及大麗輪枝菌相對豐度呈負相關，負相關系數(shù)為-0.572～-0.433。

圖2 不同樣品的稀釋曲線圖Fig.2 Rare faction curves of different samples

表2 不同樣品的OTU數(shù)量和多樣性指數(shù)(±s)Table 2 Operational taxonomic unit(OTU)and diversity indices of different samples

表2 不同樣品的OTU數(shù)量和多樣性指數(shù)(±s)Table 2 Operational taxonomic unit(OTU)and diversity indices of different samples

樣品Sample覆蓋率/%CoverageOUT 數(shù)量OTU number豐富度指數(shù) Richness indexChao1ACE多樣性指數(shù) Diversity indexShannonSimpsonH1498.28 388±309 a2 916±503 a2 978±528 a8.90±0.05 a0.99±0.00 aSY98.28 269±245 a2 855±484 a2 931±510 a8.79±0.22 a0.98±0.01 a CK98.67 696±185 a2 508±134 a2 596±103 a8.67±0.13 a0.98±0.02 a

圖3 不同樣品土壤細菌的韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of soil bacteria from different samples

2.4 細菌群落分布和組成

根據(jù)各OUT中代表序列的物種注釋結果，選取各樣品根圍土壤中細菌在門(phylum)和綱(class)分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度堆積分布圖(圖4)。由圖4-A可知，3組土壤樣品細菌在門的分類水平上，最大豐度排名前10的種類為：變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、浮霉菌門(Planctomycetes)、光合細菌門(Oxyphotobacteria)，其中變形菌門、芽單胞菌門和放線菌門在各樣品中的百分含量均大于10%，平均豐度為23.97%、26.81%和12.32%。H14處理土壤樣品中變形菌門、放線菌門的豐度比CK處理土壤樣品分別增加2.82%、28.99%，而芽單胞菌門下降31.81%；SY處理土壤樣品中變形菌門的豐度比CK處理土壤樣品分別增加 5.10%，而芽單胞菌門和放線菌門下降 7.31%和8.34%。

表3 大麗輪枝菌相對豐度及土壤細菌多樣性與黃萎病病情的相關性Table 3 Correlationship of relative abundance of Verticillium dahlia,soil bacteria diversity and occurrence of dieases

注：*表示樣本間相關性顯著。

Note：* indicate significant correlation between samples.

由圖4-B可知，3組土壤樣品細菌在綱的分類水平上，最大豐度排名前10的種類為：γ-變形菌綱 (γ-Gammaproteobacteria)、未確定的芽單單胸菌綱(unidentified_Gemmatimonadetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、未確定的光合細菌綱(unidentified_Oxyphotobacteria)、未確定的酸桿菌綱(unidentified_Acidobacteria)。其中γ-變形菌綱、未明確分類芽單胞菌綱和α-變形菌綱在各樣品中的百分含量均大于8%，平均豐度為 8.35%、22.88%和10.75%。H14處理土壤樣品中γ-變形菌綱和α-變形菌綱分別比CK處理土壤樣品分別增加5.99%和11.91%；H14處理土壤樣品中γ-變形菌綱和α-變形菌綱分別比CK處理土壤樣品分別增加8.22%和8.66%。

根據(jù)各屬在每個樣品中的豐度信息，對3組樣品中細菌豐度排名前35的屬繪制熱圖并按照樣品和物種兩個層面進行聚類(圖5)。CK與SY處理優(yōu)先聚為一類；再與H14處理聚類，可較為明顯地看出各土壤樣品中細菌群落結構的遠近。同時由圖4可發(fā)現(xiàn)不同樣品所包含的主要菌群有著較為明顯的差異。芽孢桿菌菌劑處理和對照樣品棉花根圍土壤樣品根際細菌主要有變形菌門(16個屬)、放線菌門(7個屬)和厚壁菌門(4個屬)組成，且以變形菌門種類最多，其中，H14處理土壤樣品中優(yōu)勢細菌多數(shù)屬于放線菌門和厚壁菌門。物種的聚類層面可以得知35個屬共分為A、B、C、D四大類群。由圖5可知，A類群是SY處理中的優(yōu)勢類群；C和D類群是H14處理中優(yōu)勢類群；而CK處理的優(yōu)勢類群是B類群。A類群包含8個屬，其中溶桿菌屬(Lysobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)多為生防菌，具有抑菌活性，在防治土壤病害方面發(fā)揮著積極的作用[18-19]；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)和苔蘚桿菌屬(Bryobacter)多為植物益生菌，在土壤碳、氮循環(huán)以及磷等營養(yǎng)物質轉化發(fā)揮著積極作用，從而有利于植物的生長[20]。C和D類群共含18個屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽生球菌屬(Blastococcus)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)多為生防菌[21]；斯科曼氏球菌屬(Skermanella)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)多為氮循環(huán)功能菌[22-23]，酸桿菌屬(Acidibacter)和土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)在鐵等營養(yǎng)物質轉化發(fā)揮著積極作用[24-25]。

3 討 論

同傳統(tǒng)的分子生物學方法如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等相比，高通量測序技術在研究土壤微生物群落結構及組成方面具有通量高、速度快、準確率高等優(yōu)點[11,26]。本研究利用高通量測序技術研究芽孢桿菌菌劑對棉花黃萎病病圃地棉田根圍土壤細菌多樣性及其群落組成的影響，平均每個樣品生成2 673個OUT，劃分為54個門、67個綱、135個目、244個科和571個屬，覆蓋率均大于98%；序列數(shù)量增加到一定程度后，稀釋曲線趨于平坦，測序深度可靠，可真實反映樣品中細菌群落多樣性和結構組成。多數(shù)農田土壤類型優(yōu)勢菌群主要有變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和浮霉菌門組成，本試驗高通量測序結果表明各樣品優(yōu)勢菌群(含量大于5%)為變形菌門、芽單胞菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，這與同呂寧等[27]研究多年連作棉田細菌群落多樣性的結果基本一致，但菌群的比例存在差異，這可能與棉花黃萎病病圃地同多年連作棉田的土壤生態(tài)環(huán)境差異有關，致使菌群的物種多樣性基本一致，但是菌群的豐富度不同。

圖4 門(A)和綱(B)水平上的細菌相對豐度Fig.4 Relative abundances of bacteria at phylum(A) and class(B)

圖5 各樣品中細菌排名35屬的豐度聚類熱圖Fig.5 Heatmap of bacterial communities based on levels of 35 most abundant genera in each sample

土壤微生物是評價土壤質量的重要指標，并且微生物多樣性同土壤健康和土傳病害發(fā)生有重要的關系[28]。生防微生物的施用有助于提高作物根圍土壤微生物多樣性，從而抑制土傳病原菌的生長繁殖和病害的發(fā)生。韓騰等[29]發(fā)現(xiàn)灌根施用枯草芽孢桿菌Tpb55提高了煙草根圍細菌群落多樣性，并能減輕煙草黑脛病發(fā)病程度，延遲發(fā)病時間。本試驗研究結果表明，施用芽孢桿菌菌劑不僅提高了土壤細菌群落物種的豐富度還增加了物種的多樣性，而且水分散粒劑H14提高作用更加明顯。以往研究發(fā)現(xiàn)，同多年連作的重病田相比，健康農田土壤微生物多樣性更加豐富[9]，因此施用水分散粒劑H14，更有利于維持土壤中有益菌和病原菌之間的平衡，降低棉田土傳病害的發(fā)生。3組樣品中豐度排名前35的屬按照樣品和物種兩個層面聚類共分為A、B、C、D四大類群，其中A類群是SY處理中的優(yōu)勢類群；C和D類群是H14處理中優(yōu)勢類群；而對照處理的優(yōu)勢類群是B類群，表明不同處理樣品均形成了各自的優(yōu)勢菌群。進一步通過對相關菌屬的功能分析可以發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌菌劑施用后可以提高生防菌相關屬的豐度，如A類群中的溶桿菌屬、假單胞菌屬，C、D類群中的芽孢桿菌屬、芽生球菌屬和類諾卡氏菌屬；另外也提高了參與土壤碳氮循環(huán)以及磷鐵等營養(yǎng)元素轉化相關功能菌的豐度，如A類群的鞘氨醇單胞菌屬、生絲微菌屬、Bryobacter屬，C、D類群斯科曼氏球菌屬、亞硝化螺菌屬、酸桿菌屬和土壤紅桿菌屬。Wu等[30]研究發(fā)現(xiàn)施用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)ZM9可以顯著提高土壤中芽孢桿菌和假單胞菌等生防菌的豐度，并降低了煙草青枯病的發(fā)病率。Wan等[20]高通量測序發(fā)現(xiàn)馬鈴薯枯萎病拮抗解淀粉芽孢桿菌SN16-1提高了土壤中類諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度，進一步分析發(fā)現(xiàn)這些菌屬是通過產(chǎn)生拮抗物質、誘導作物產(chǎn)生抗病性、產(chǎn)生鐵載體和促進磷酸鹽溶解等方式促進作物生長并提高其抗病性。

本研究施用水分散粒劑H14后，棉花黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)較對照處理顯著降低，進一步分析發(fā)現(xiàn)與之成正相關的大麗輪枝菌的相對豐度也顯著降低，而土壤中細菌群落物種豐富度和多樣性有所升高。結合水分散粒劑H14施用后土壤細菌屬水平上相關生防菌和營養(yǎng)元素轉化功能菌的變化，可以歸結出水分散粒劑H14可以通過提高防治土傳病害、促進土壤碳氮循環(huán)和磷鐵等營養(yǎng)元素轉化的相關菌屬的數(shù)量，來抑制棉花黃萎病病原菌的生長和繁殖，促進棉花健康生長。