項 萍，唐 喆

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥赤霉病是世界范圍內(nèi)流行性病害，會導(dǎo)致糧食減產(chǎn)和品質(zhì)下降。染病作物產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(即嘔吐毒素DON)對人畜有很大的毒害作用，直接對人畜健康和生命安全構(gòu)成威脅[1-2]。禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)是小麥赤霉病的主要致病菌[3-4]，科學(xué)家們對禾谷鐮刀菌的生長習(xí)性、毒素分泌、致病機(jī)理、侵染小麥的機(jī)理等多個方面進(jìn)行研究，以期通過生物學(xué)方法解決赤霉病害。近年來，代謝組學(xué)[5]概念的提出為研究者提供了新的思路，代謝組學(xué)主要研究生物體對病理生理刺激或基因修飾所產(chǎn)生代謝物的質(zhì)和量的動態(tài)變化規(guī)律。這種整體研究模式可以全面了解代謝物質(zhì)在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律，利用代謝組學(xué)分析手段研究真菌基因功能可以豐富真菌基因鑒定的手段，進(jìn)一步了解抗病機(jī)制，最終達(dá)到防治病害的目的[6]。

代謝指紋分析(Metabolite fingerprinting analysis)[7-9]是代謝組學(xué)研究的方法之一，主要是運(yùn)用某一種或多種不同的分析手段對細(xì)胞內(nèi)大量代謝物進(jìn)行掃描分析。代謝指紋分析常用的分析手段有核磁共振(NMR)、傅氏變換紅外光譜(FT-IR)以及與MS相聯(lián)用的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)等[10]，其中GC-MS可用于分析揮發(fā)性的有機(jī)物以及衍生化以后具有揮發(fā)性的初級代謝物[11]，并且基于GC-MS具有廣泛成熟的數(shù)據(jù)庫便于檢索確定物質(zhì)組成。本研究建立了GC-MS檢測分析禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)物方法，采用2種衍生化方法進(jìn)行檢測，并對代謝產(chǎn)物指紋圖譜進(jìn)行分析，為禾谷鐮刀菌致病機(jī)理研究提供參考，為真菌類物質(zhì)的代謝組學(xué)分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜儀(Aoc-20i自動進(jìn)樣器、色譜柱型號(Rxi-5ms，30 m×0.25 mm×0.25 μm，島津公司)，SOH-72E高溫分解干燥箱(Smart lab公司)，Sep-Pak C18固相萃取柱(6 mL 500 mg，Waters公司)，GY-DCY-24S氮吹儀(海歸永電子有限公司)，Vortex-Genie2渦旋震蕩器(Scientific Industries公司)，0.45 μm玻璃纖維濾膜(美國PALL公司)。

吡啶(色譜純，Sigma公司)、氯甲酸甲酯(MCF)(分析純Sigma公司)、三甲基硅烷咪唑(TMSI)(分析純，F(xiàn)luka公司)、三甲基氯硅烷(TMCS)(色譜純，Sigma公司)、異辛烷(色譜純，Merck公司)、氯仿(色譜純，Sigma公司)其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購于天津富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 菌株

禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮實驗室保存。

MM培養(yǎng)基：NaNO3(2 g)、 KH2PO4(1 g)、KCl (0.5 g)、MgSO4·7H2O (0.5 g)、蔗糖 (30 g)、FeSO4·7H2O (10 mg)、瓊脂(15 g)，加水定容至1 L，調(diào)整pH為5.6，121 ℃，滅菌15 min；CM培養(yǎng)基：葡萄糖(10 g)、絡(luò)蛋白氨基酸(1 g)、酵母提取物(1 g)、蛋白胨(2 g)、NaNO3(6 g)、MgSO4·7H2O(1.023 g)、KH2PO4(1.5 g)、KCl(0.5 g)、瓊脂(15 g)加水定容至1 L，調(diào)整pH為6.5，121 ℃，滅菌15 min。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 菌絲樣品的制備 將-80 ℃保存的禾谷鐮刀菌野生型PH-1菌株活化于小皿上，25 ℃培養(yǎng)4 d；然后用直徑1 cm打孔器打孔得到菌餅，接種5個菌餅于50 mL液體培養(yǎng)基，25 ℃ 150 r/min培養(yǎng)10 d；所得到的菌絲用無菌濾布過濾，并用無菌水沖洗干凈，再用吸水紙將充分吸干水分，然后放于滅菌研缽中，加入液氮并充分研磨，再轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，放于冷凍干燥儀中，干燥過夜，得到菌絲樣品。

1.3.2 代謝產(chǎn)物的提取 稱取30 mg干燥后菌絲于離心管內(nèi)，加入6 mL甲醇提取液，在渦旋儀上1 400 r/min劇烈渦旋10 min，直到菌體徹底懸浮，搖動數(shù)小時后，離心10 min。轉(zhuǎn)移1 mL上清于2 mL離心管中，使用氮吹儀用氮?dú)獯蹈?，得到菌絲代謝產(chǎn)物樣品。

1.3.3 衍生化處理 甲基衍生化：將“1.3.2”所得代謝產(chǎn)物樣品加入200 μL NaOH(1%，0.1 g/mL)200 μL甲醇/吡啶混合溶液(體積比 5∶1)、20 μL 氯甲酸甲酯(MCF)，震蕩1 min；加入800 μL色譜純氯仿，上下劇烈顛倒；加入400 μL NaHCO3(50 mmol/L，4.2 g/L)，上下劇烈顛倒，取下層清液于新的1.5 mL離心管中；加入Na2SO4干燥，靜置5 min轉(zhuǎn)移500～700 μL于GC-MS進(jìn)樣瓶中，待測。

硅烷衍生化：將“1.3.2”所得代謝產(chǎn)物樣品中加入100 μL的1 mol/L HCl，劇烈渦旋10 min，直到管內(nèi)物質(zhì)充分接觸懸浮；50 ℃孵育1 h，吹干，加入50 μL TMS硅烷化試劑(TMSI∶ TMCS=100∶1)劇烈渦旋10 min，保證管內(nèi)所有物質(zhì)與TMS充分接觸，37 ℃孵育1 h，加入800 μL色譜純異辛烷，再加入800 μL超純水上下輕微顛倒，靜置10 min直到分層，轉(zhuǎn)移500～700 μL有機(jī)相于GC-MS進(jìn)樣瓶中。

1.4 GC-MS檢測方法

1.4.1 甲基衍生化分析方法 載氣He，0.9 mL/min；清洗流速3 mL/min，壓力：49.3 kPa。

升溫程序：柱溫60 ℃(5 min)，保持2 min，以8 ℃/min升溫至180 ℃保持5 min，以40 ℃/min升溫至220 ℃保持5 min，以40 ℃/min升溫至240℃保持12.5 min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜轟擊電壓70 eV，EI模式，接口溫度 260 ℃；離子源溫度260℃；檢測器電壓1.0 kV；溶劑切割時間3 min；掃描范圍35～550m/z。

1.4.2 硅烷衍生化分析方法 載氣He，1 mL/min；清洗流速3 mL/min，壓力：80.8 kPa，分流比5.0。

升溫程序：柱溫120 ℃(5 min)，保持5 min，以4 ℃/min升溫至300 ℃保持15 min；進(jìn)樣口溫度260 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜轟擊電壓70 eV，EI模式，接口溫度 275 ℃；離子源溫度200 ℃；檢測器電壓1.0 kV；溶劑切割時間3 min；掃描范圍35～550m/z。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理 使用島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀自帶NIST08和NIST08s兩個譜庫對結(jié)果進(jìn)行檢索，對相似度70%以上的代謝產(chǎn)物進(jìn)行 指認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲培養(yǎng)條件對代謝產(chǎn)物的影響

分別選取培養(yǎng)5 d、10 d、15 d、20 d和25 d 5個時間段的野生型PH-1菌株進(jìn)行測試，觀察培養(yǎng)時間對代謝產(chǎn)物的影響，經(jīng)TMS衍生化后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)10 d所得菌絲的代謝產(chǎn)物最充分，大部分產(chǎn)物在總離子流圖上的響應(yīng)值最高，適宜代謝產(chǎn)物的分析，結(jié)果見圖 1。選用2種不同營養(yǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)豐富的CM培養(yǎng)基中TMS衍生化處理的代謝產(chǎn)物比營養(yǎng)簡單的MM培養(yǎng)基豐富(圖2)。因此，后續(xù)試驗選用培養(yǎng)周期10 d和CM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)條件。

圖1 PH-1在不同培養(yǎng)時間通過TMS衍生化后的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) plot of PH-1 cultured in different time with TMS derivatization

圖2 來自MM和CM培養(yǎng)基中的經(jīng)過TMS代謝物總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram(TIC) plot of MM medium and CM medium with TMS derivatization

2.2 MCF衍生化結(jié)果分析

采用MCF甲基衍生化后進(jìn)行GC/MS分析，檢測結(jié)果總離子流圖見圖3，根據(jù)NIST08和NIST08s譜庫指認(rèn)代謝產(chǎn)物26種，結(jié)果見表1，使用面積歸一化法計算物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比，其中氨基酸類物質(zhì)有6種，比例為1.62%；烷烴烯烴類物質(zhì)9種，占7.4%；7種脂肪酸類物質(zhì)，占74.52%，其他酯類醛類占16.46%。

2.3 TMS衍生化結(jié)果分析

通過TMS硅烷衍生化后進(jìn)行GC/MS分析，檢測結(jié)果總離子流圖見圖4，根據(jù)NIST08和NIST08s譜庫指認(rèn)代謝產(chǎn)物37種，結(jié)果見表2，使用面積歸一化法計算物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中糖醇類物質(zhì)29種，占96.24%；脂肪酸檢測到3種約占1%，另外其他物質(zhì)主要是麥角固醇類等約占3%。

圖3 MCF衍生化野生型赤霉菌代謝產(chǎn)物的GC/MS分析總離子流圖Fig.3 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

表1 MCF衍生化野生型赤霉菌代謝產(chǎn)物的GC/MS分析結(jié)果Table 1 Result of PH-1 metabolites with MCF derivatization by GC/MS

圖4 TMIS衍生化野生型赤霉菌代謝產(chǎn)物的GC/MS分析總離子流圖Fig.4 Total ions chromatogram of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

3 討論與結(jié)論

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)是小麥赤霉病的一種優(yōu)勢致病菌，能導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降，并產(chǎn)生有害的真菌毒素，給小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展帶來了很大困難。利用代謝組學(xué)分析手段研究小麥赤霉病禾谷鐮刀菌所產(chǎn)生代謝物的質(zhì)和量的動態(tài)變化規(guī)律，可進(jìn)一步了解抗病機(jī)制，最終實現(xiàn)小麥赤霉病的防治。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)是代謝指紋分析的常用手段，然而對禾谷鐮刀菌的代謝產(chǎn)物分析尚未有報道。本研究構(gòu)建了禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)物的分析方法，通過篩選代謝產(chǎn)物多樣化的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)10 d和CM培養(yǎng)基為產(chǎn)物多樣化的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步針對不易氣化的代謝產(chǎn)物，采用2種衍生化方法，分別分析了其代謝產(chǎn)物。其中氯甲酸甲酯(MCF)作為?；噭苌磻?yīng)迅速、產(chǎn)物單一且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能同時衍生有機(jī)酸、游離脂肪酸、酚類、氨基酸類和胺類物質(zhì)，通過MCF衍生化發(fā)現(xiàn)了26種代謝產(chǎn)物。其中氨基酸類物質(zhì)有6種，烷烴烯烴類物質(zhì)9種，脂肪酸類物質(zhì)7種，其他酯類醛類4種。硅烷化(TMS)也是常見的衍生化試劑，此類衍生化產(chǎn)物具有易于制備、衍生化后可直接進(jìn)行氣相色譜分析的特點(diǎn),這樣節(jié)省了樣品制備時間，通過TMS衍生化發(fā)現(xiàn)了37種代謝產(chǎn)物，其中糖醇類物質(zhì)29種，脂肪酸檢測到3種，其他麥角固醇類5種。比較該2種衍生化方法，發(fā)現(xiàn)MCF衍生化可檢測的種類有氨基酸、烷烴烯烴和脂肪酸類等，而TMS衍生化主要檢測了糖醇類，二者相互補(bǔ)充。根據(jù)以上2種衍生化處理的指紋圖譜結(jié)果可以看出糖醇類物質(zhì)和脂肪酸類物質(zhì)是禾谷鐮刀菌的主要代謝產(chǎn)物，其他氨基酸類、烯烴、烷烴等物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不高，但也是常規(guī)存在的代謝產(chǎn)物。

表2 TMIS衍生化野生型赤霉菌代謝產(chǎn)物的GC/MS分析結(jié)果Table 2 Result of PH-1 metabolites with TMS derivatization by GC/MS

本試驗采用2種不同衍生化方法，對禾谷鐮刀菌的野生型菌株樣品進(jìn)行了代謝指紋分析共指認(rèn)出63種代謝產(chǎn)物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的為糖醇類物質(zhì)和脂肪酸類物質(zhì)；比較了不同的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基對禾谷鐮刀菌代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)10 d的培養(yǎng)時間代謝產(chǎn)物最完全，適宜做代謝產(chǎn)物的分析；培養(yǎng)基的營養(yǎng)對代謝產(chǎn)物有一定的影響，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲代謝產(chǎn)物相對更豐富。通過以上研究為禾谷鐮刀菌深入的代謝組學(xué)研究提供參考，也為禾谷鐮刀菌致病機(jī)理研究提供 依據(jù)。