汪雙祝，溫 睿，王康康，田露陽(yáng)，孟 清，林 瑛

東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620

蜘蛛絲是一種天然的高分子蛋白纖維，并因其優(yōu)異的性能及巨大的應(yīng)用前景而受到科研人員的廣泛關(guān)注，蜘蛛絲在生物醫(yī)學(xué)上有十分優(yōu)良的應(yīng)用前景，包括可以作為組織工程支架，藥物運(yùn)輸載體和神經(jīng)導(dǎo)管等。一只成熟的雌性圓網(wǎng)蜘蛛具有7種不同的絲腺體，并且能夠紡出6種不同的絲纖維以及一種粘液蛋白[1]。這些不同類(lèi)型的絲纖維各自具有獨(dú)特的機(jī)械性能并具有不同的用途[1]。目前已有多條蜘蛛絲的全基因編碼序列的報(bào)道，還有研究對(duì)蛛絲蛋白的部分結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了高級(jí)結(jié)構(gòu)解析[2-4]。如何簡(jiǎn)便、低成本地合成仿生蜘蛛絲纖維一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而蛛絲蛋白成絲機(jī)理的研究是蛛絲蛋白仿生應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題。20世紀(jì)初針對(duì)蛛絲成絲機(jī)理提出了兩種假說(shuō)，分別是“液晶態(tài)模型(liquid crytal theory)”[5]和“小球模型(micelle theory)[6]”，但都不能完整的闡述其組裝成絲的過(guò)程。

七種蛛絲纖維中拖絲因其高強(qiáng)度受到研究者青睞，關(guān)于管狀腺絲的研究相對(duì)較少。管狀腺絲主要由TuSp1蛋白構(gòu)成，是蜘蛛卵袋外層絲的主要成分，用于保護(hù)蜘蛛卵免受外界環(huán)境侵害，其強(qiáng)度可達(dá)1 GPa，且硬度在幾種蛛絲纖維中是最強(qiáng)的[6-8]，具有很好的仿生應(yīng)用前景。關(guān)于大腹園蛛TuSp1的全基因序列在2017才被報(bào)道出來(lái)[9]。與其他蛛絲蛋白類(lèi)似，大腹園蛛TuSp1蛋白可分為三個(gè)部分：非重復(fù)氨基末端結(jié)構(gòu)域(NT)，非重復(fù)羧基末端結(jié)構(gòu)域(CT)以及位于蛋白序列中央的重復(fù)區(qū)(Rp)[10-14]；并且相比于其他蛛絲蛋白，TuSp1的基因序列較小，其包含9個(gè)重復(fù)單元，序列中富含丙氨酸與絲氨酸[9]。但目前仍缺乏對(duì)大腹園蛛TuSp1結(jié)構(gòu)與功能的研究，關(guān)于大腹園蛛TuSp1的蛋白表達(dá)及是否能自組裝成絲的問(wèn)題也沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

為了使管狀腺蛛絲蛋白TuSp1得到更好的仿生應(yīng)用，本文采用PCR技術(shù)從已獲取的大腹園蛛TuSp1的完整基因序列中擴(kuò)增出其N(xiāo)T，CT以及Rp三種結(jié)構(gòu)域序列，成功構(gòu)建出大腹園蛛重組TuSp1 NT-Rp-CT克隆，并對(duì)其進(jìn)行蛋白表達(dá)，純化。通過(guò)對(duì)不同pH條件下重組蛋白液圓二色譜測(cè)試來(lái)初步分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同pH下的變化。并進(jìn)一步對(duì)重組蛋白凍干、重溶及濕法紡絲，進(jìn)行紅外光譜測(cè)試來(lái)探討重組蛋白絲纖維成形后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)。最后用掃描電鏡觀察了大腹園蛛天然包卵絲纖維(TuSp1)、重組蛋白凍干形成的絮狀物及濕紡后的絲纖維的具體形態(tài)特征，以探索其自組裝成絲的能力。這些研究都為T(mén)uSp1成絲機(jī)理以及人工蛛絲纖維制備提供了有力的數(shù)據(jù)支持與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒擴(kuò)增宿主細(xì)胞大腸桿菌T1與表達(dá)宿主細(xì)胞BL21(DE3)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收等用于克隆表達(dá)的試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA酶聚合酶購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶與DNA連接酶購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))；測(cè)序在上海睿迪生物有限公司進(jìn)行。蛋白純化相關(guān)試劑購(gòu)于Qiagen公司(德國(guó))；Western blot相關(guān)試劑購(gòu)于Invitrogen 公司(美國(guó))。

1.2 重組蛛絲蛋白克隆的構(gòu)建與表達(dá)

1.2.1克隆構(gòu)建

根據(jù)獲取的大腹園蛛A.v. TuSp1的完整基因序列，設(shè)計(jì)引物分別克隆A.v. TuSp1的NT-R、CT。在重復(fù)區(qū)編碼序列反向PCR引物和CT端正向引物引入NdeI酶切位點(diǎn)，NT端正向引物引入NheI酶切位點(diǎn)，CT端反向引物引入Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列如表1。以提取的大腹園蛛基因組DNA為模板，NT端正向引物PNTF與R反向引物PR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得片段NT-R、CT；以CT端正、反向引物PCTF和PCTR可擴(kuò)增出CT片段。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，具體為：基因組DNA模板1 μL，正反向引物各2 μL，混合物2×TaqPlus Master Mix 25 μL，最后用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃ 補(bǔ)平10 min，4 ℃保存。之后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并使用試劑盒進(jìn)行膠回收。

對(duì)PCR反應(yīng)回收得到的片段產(chǎn)物NT-R、CT以及表達(dá)載體質(zhì)粒ppSUMO進(jìn)行酶切，室溫下連接1 h，獲取完整的重組表達(dá)質(zhì)粒TuSp1 NT-Rp-CT。

表1 Mini-TuSp1 PCR引物

注: 下劃線標(biāo)記堿基序列依次為NheI、NdeI、NdeI和XhoI酶切識(shí)別序列。

1.2.2TuSp1 NT-Rp-CT重組蛋白的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21( DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布于平板上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。挑平板上單克隆接種于10 mL LB培養(yǎng)基中(Amp抗性，濃度為100 μg /mL)。隨后過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶100比例轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度0. 3 mmol /L IPTG，16 ℃、180 r/min，過(guò)夜誘導(dǎo)。

5 000 r /min、4 ℃、15 min離心收集過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，加入50 mL 20 mmol /L Tris-HCl(pH 8.0)進(jìn)行重懸并置于冰上，隨后利用JN-3000 plus型高壓細(xì)胞破碎機(jī)(100 MPa)進(jìn)行菌體破碎，重復(fù)破碎3次后將其用50 mL離心管收集。分別取樣上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，最終發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要表達(dá)在沉淀里。然后棄上清，收集沉淀，在其中加入50 mL 含6 mol/L的鹽酸胍裂解緩沖液進(jìn)行重懸，待沉淀大致溶解后，采用350 W超聲破碎的方式進(jìn)一步混勻(超聲5 s，間隔7 s，重復(fù)99次)。重懸混勻后，10 000 r/min、4 ℃、30 min離心收集上清進(jìn)行蛋白純化。因重組蛋白帶有6×His標(biāo)簽，所以實(shí)驗(yàn)中使用鎳柱親和純化目的蛋白，具體純化步驟參考Qiagen鎳柱使用手冊(cè)。

1.2.3重組蛋白的濕法紡絲

將純化透析后的重組蛋白放于凍干機(jī)中冷凍過(guò)夜，凍干后的重組蛋白按20%比例溶于六氟異丙醇中，溶解完全后對(duì)其進(jìn)行高速離心以除去紡絲液內(nèi)的不溶雜質(zhì)。紡絲凝固浴選取100%甲醇，紡絲槽的溫度設(shè)定為25 ℃。使用微量勻速泵將紡絲液以恒定流速推入凝固浴中，并立即用鑷子夾住已形成的絲纖維開(kāi)始拉伸，經(jīng)過(guò)一段距離后拉出凝固浴，纏繞于馬達(dá)上的線軸上。不斷調(diào)整線軸的角速度直至絲纖維的直徑變得均勻且絲纖維表面呈現(xiàn)出較光滑的狀態(tài)，收集絲纖維置于通風(fēng)櫥內(nèi)24 h促使甲醇揮發(fā)干凈。

1.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)試

1.3.1圓二色譜測(cè)試

將經(jīng)鎳柱純化的目的重組蛋白透析于5 L的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中，再轉(zhuǎn)移至濃縮管進(jìn)行濃縮。測(cè)試前，先使用不同pH(7.0、6.5、6.0、5.5)的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)⑹沟鞍兹芤旱慕K濃度保持在0.1～0.3 mg/mL，稀釋后的蛋白液可用于圓二色譜測(cè)試。設(shè)置測(cè)試條件參數(shù)：設(shè)定光譜范圍為190 nm～260 nm，波長(zhǎng)的帶寬(bandwith)為1 nm，波長(zhǎng)步進(jìn)(wavelength step)1 nm，平均時(shí)間(averaging time)為0.5 s，多次掃描等待時(shí)間(multi-scan wait)0 s；測(cè)量得到的CD圖譜使用CD Spectroscopy Deconvolution Software(CDNN 2.1)進(jìn)行平均、背景消除及平滑處理。

1.3.2紅外光譜測(cè)試

對(duì)濕法紡絲后的蛋白絲纖維利用傅里葉變換紅外-拉曼光譜儀(NEXUS-670，USA)進(jìn)行紅外光譜(ATR-FTIR)測(cè)試 ，操作嚴(yán)格確保室內(nèi)溫度且濕度控制在65%以下。最后所得的圖譜用Peakfit V4.12軟件處理，對(duì)位于酰胺Ⅰ帶(1 700 cm-1～1 600 cm-1)的拉曼光譜二階導(dǎo)算法處理后進(jìn)行Gauss峰行擬合，估算子峰的位置以及個(gè)數(shù)，擬合后使殘差滿足r2≥ 0.999，使用Origin 8對(duì)擬合后的圖譜繪圖，分析子峰與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)峰面積計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比例。

1.4 掃描電鏡觀察

對(duì)重組蛋白凍干形成的絮狀物和濕紡后的絲纖維進(jìn)行電鏡掃描。制備樣品，噴金20 s。用日立TM-1000 臺(tái)式掃描電鏡，采用12 kV電壓，BSD模式觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 重組克隆的鑒定

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定，后提取質(zhì)粒送于生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)SnapGene軟件，對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)突變與移碼現(xiàn)象，重組表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。完整的重組蛛絲蛋白TuSp1 NT-Rp-CT氨基酸序列如圖1所示，其中紅色區(qū)域?yàn)門(mén)uSp1的NT端氨基酸序列，灰色區(qū)域?yàn)闉門(mén)uSp1的重復(fù)區(qū)Rp端的氨基酸序列，黃色區(qū)域?yàn)門(mén)uSp1的CT端氨基酸序列。由于目前對(duì)重組蛛絲蛋白的純化大多采用的是鎳柱親和純化且6×His標(biāo)簽對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)表征無(wú)影響[15,16]，所以本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆構(gòu)建，在重組表達(dá)質(zhì)粒的NT端成功引入了6×His標(biāo)簽，方便蛋白表達(dá)鑒定與純化以制備絲纖維。

圖1 重組蛋白TuSp1 NT-Rp-CT的氨基酸序列

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌進(jìn)行外源誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果如圖2(A)所示，與誘導(dǎo)前泳道N相比，誘導(dǎo)后泳道I中的外源重組蛋白得到大量表達(dá)，并通過(guò)Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證了其表達(dá)的蛋白為所要的重組蛛絲蛋白TuSp1 NT-Rp-CT，大小約為50 600，且與上清泳道S相比，大部分蛋白表達(dá)在沉淀里。所以在后續(xù)蛋白純化實(shí)驗(yàn)中通過(guò)加入50 mL 6 mol/L的鹽酸胍使蛋白質(zhì)充分變性，促進(jìn)重組蛋白的溶解。

經(jīng)鹽酸胍溶解后的重組蛋白大部分溶于上清中，采用鎳柱進(jìn)行親和純化，蛋白純化后的結(jié)果如圖2(B)所示，經(jīng)Image J軟件處理分析，純化后的重組蛋白純度高達(dá)90%。收集純化后的蛋白液，透析去除尿素，4 ℃儲(chǔ)存，以用于二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

M: 蛋白質(zhì)marker；N: 誘導(dǎo)前；I: 誘導(dǎo)后；S:上清; P: 沉淀；E: 純化后的重組蛋白
圖2 重組蛋白TuSp1 NT-Rp-CT的表達(dá)與純化

2.3 重組蛛絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

CD圖譜表明，不同pH條件下，重組蛋白均呈現(xiàn)出α-螺旋的特征吸收峰，即在192 nm處為正峰，在208 nm和222 nm處為負(fù)峰，但不同pH條件下CD曲線幾乎重疊，如圖3所示，說(shuō)明TuSp1 NT-Rp-CT重組蛋白均以α-螺旋構(gòu)象的形式穩(wěn)定存在。

圖3 重組蛛絲蛋白不同pH的CD圖譜

對(duì)濕紡成絲后的蛋白纖維進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，如圖4所示，在(1 600～1 700) cm-1之間有吸收峰，位于酰胺Ⅰ帶區(qū)域，其中峰位在(1 650～1 658) cm-1的為α-螺旋，(1 605～1 639) cm-1與(1 690～1 695) cm-1的為β-折疊，(1 659～1 689) cm-1的為β-轉(zhuǎn)角，(1 640～1 649) cm-1的為無(wú)規(guī)卷曲。采用基線校正，Gaussian去卷積，二階導(dǎo)數(shù)擬合對(duì)紅外光譜進(jìn)行處理，根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例，結(jié)果顯示(表2)，β-折疊所占含量最高，且與重組蛋白液CD圖譜相比，其α-螺旋有所下降，已不是主要二級(jí)結(jié)構(gòu)組分。

圖4 重組蛛絲蛋白的紅外光譜圖譜

表2 重組蛋白絲纖維的二級(jí)結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)

2.4 重組蛛絲蛋白的掃描電鏡表面觀察

采用掃描電鏡來(lái)觀察重組蛛絲蛋白TuSp1 NT-Rp-CT的絲纖維形態(tài)，電鏡結(jié)果如圖5所示。其中圖A與圖B分別展示的是電鏡倍數(shù)為1 000×與5 000×下的天然包卵絲(TuSp1)纖維；圖C與圖D展示的是電鏡倍數(shù)為1 000×與5 000×下濕紡后的重組蛛絲蛋白纖維。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，濕紡形成的重組蛛絲蛋白纖維表面整體光滑，略顯粗糙且具有細(xì)小孔徑，直徑約24.6 μm，比天然蛛絲粗但整體較均勻。

圖E與圖F展示的是電鏡倍數(shù)為1 000×與5 000×下凍干后重組蛋白自組裝絲纖維，其結(jié)果說(shuō)明重組蛛絲蛋白在進(jìn)行凍干過(guò)程中不施加外力的情況下具有自組裝成絲的能力，且絲纖維表面光滑，直徑較小，形態(tài)更接近于天然蛛絲纖維。

3 結(jié)果與討論

蛛絲蛋白的NT結(jié)構(gòu)域、CT結(jié)構(gòu)域和重復(fù)區(qū)在成絲過(guò)程中起到不同的作用，有文獻(xiàn)報(bào)道蛛絲蛋白中影響絲纖維機(jī)械性能的主要為重復(fù)區(qū)的數(shù)量和模塊不同，而NT與CT作為大多數(shù)蛛絲蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?qū)Τ山z也具有不同的調(diào)節(jié)作用，所以對(duì)蛛絲蛋白三種基本結(jié)構(gòu)的探索是闡述其成絲機(jī)制的必要條件[17-21]。目前已有大腹園蛛TuSp1蛛絲蛋白的全長(zhǎng)基因序列，并且其氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示NT結(jié)構(gòu)域存在5個(gè)α-螺旋和兩個(gè)半胱氨酸殘基，CT結(jié)構(gòu)域存在6個(gè)α-螺旋，但對(duì)大腹園蛛TuSp1蛋白還缺乏深入研究，這限制了TuSp1蛋白成絲機(jī)理的探索和仿生應(yīng)用。

為解決這一問(wèn)題，本研究模擬天然蛛絲結(jié)構(gòu)，通過(guò)克隆構(gòu)建成功獲取重組蛛絲蛋白TuSp1 NT-Rp-CT。經(jīng)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白TuSp1 NT-Rp-CT主要表達(dá)在沉淀里，分析原因可能是重組蛋白在大腸桿菌中易于表達(dá)，且表達(dá)量很高，合成速度太快以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，從而以不可溶的狀態(tài)即包涵體的形式存在[22]。為了獲取高純度的重組蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們采用強(qiáng)變性劑鹽酸胍使蛋白充分變性并溶于上清，進(jìn)行鎳柱親和純化和梯度透析復(fù)性后，最終得到了高純度的重組蛋白液。CD圖譜表明重組蛋白主要以α-螺旋構(gòu)象存在，并且發(fā)現(xiàn)不同pH條件下的CD曲線無(wú)明顯變化，說(shuō)明一定范圍下的pH波動(dòng)對(duì)重組蛋白TuSp1 NT-Rp-CT的結(jié)構(gòu)無(wú)影響，其結(jié)構(gòu)改變可能發(fā)生在高級(jí)結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。但對(duì)比成絲后的蛋白絲纖維的紅外光譜結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其紡成絲纖維后二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋構(gòu)象主要轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊與β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象。推斷這種結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)可能是由于純化后的蛋白進(jìn)行了高濃度的重溶，隨后在濕紡中施加了一定的剪切力，使得其快速成為固體絲纖維，當(dāng)然這其中還包含許多復(fù)雜的環(huán)境因素，有待進(jìn)一步考究[5, 6]。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中獲得了其濕紡前的蛋白絲纖維，說(shuō)明重組蛋白具有自組裝成絲的能力，并進(jìn)一步對(duì)紡絲前后的蛋白絲纖維進(jìn)行了電鏡掃描觀察，發(fā)現(xiàn)二者形態(tài)均接近天然蛛絲，但濕紡后的絲纖維較粗且具有細(xì)小孔徑，推測(cè)可能是在濕紡過(guò)程中手法的限制及其他環(huán)境因素的影響。

綜上所述，本文通過(guò)外源表達(dá)純化成功獲得了TuSp1 NT-Rp-CT重組蛋白，表達(dá)量可達(dá)70 mg/L；探究了重組蛋白在成絲過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。上述研究結(jié)果為探究大腹園蛛TuSp1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其高級(jí)結(jié)構(gòu)解析奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)TuSp1蛋白成絲機(jī)理進(jìn)行了初步探索，為其仿生應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。