馮 煒，史勁松

江南大學(xué) 藥學(xué)院，無(wú)錫 214122

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生長(zhǎng)因素，可提高血管的通透性[1]，是誘導(dǎo)腫瘤血管形成的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子[2]。因此，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)[3]?？筕EGF治療的第一代藥物是諾華公司的Lucentis和羅氏公司的Avastin，前者價(jià)格昂貴，而后者價(jià)格低廉，在很多國(guó)家作為非標(biāo)簽用藥，市場(chǎng)巨大[3, 4]。抗VEGF治療的第二代藥物是德國(guó)拜耳的Eylea和我國(guó)成都康弘生物科技有限公司的朗沐，此類藥物是一種融合蛋白，可以與VEGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF受體，抑制VEGF產(chǎn)生作用，作用比第一代的抗VEGF藥物更強(qiáng)。Eylea目前在海外市場(chǎng)已經(jīng)占據(jù)相當(dāng)大的市場(chǎng)份額，而朗沐在我國(guó)已開(kāi)始臨床三期試驗(yàn)，表現(xiàn)出顯著的治療效果[5-8]。然而，前兩代抗VEGF治療的藥物都只適用于眼底病治療的藥物，應(yīng)用范圍受到很大的限制。近年來(lái)，單克隆抗體類藥物發(fā)展迅猛，已被廣泛用于惡性腫瘤、免疫學(xué)疾病和罕見(jiàn)病等多個(gè)適應(yīng)癥的治療[9]，目前已有超過(guò)300種單克隆抗體藥物處于臨床試驗(yàn)階段[10]。與第一代和第二代抗VEGF藥物相比，抗VEGF單克隆抗體的應(yīng)用范圍更加廣泛。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)細(xì)胞株表達(dá)抗VEGF人源化單克隆抗體(VEGF-MA)，并對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得更高的目的蛋白產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

本研究所用細(xì)胞株為重組CHO細(xì)胞。目的產(chǎn)物為VEGF-MA，93%的序列為人源，7%的序列為鼠源(位于可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR)，每個(gè)輕鏈由214個(gè)氨基酸組成，每個(gè)重鏈由453個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為149 000。

1.2 培養(yǎng)基

(1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：本研究選取14種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，編號(hào)以及濃度如表1所示。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

(2) 補(bǔ)料培養(yǎng)基：本研究選取10種補(bǔ)料培養(yǎng)基，編號(hào)以及濃度如表2所示。

表2 補(bǔ)料培養(yǎng)基

(3) 外源添加物：本研究選取7種能夠促進(jìn)VEGF-MA表達(dá)的外源添加物，為方便添加，將其配制成溶液，溶液濃度以及編號(hào)如表3所示。

表3 外源添加物

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1細(xì)胞復(fù)蘇及搖瓶擴(kuò)增

從液氮罐中取出凍存細(xì)胞37 ℃水浴解凍，將解凍后的凍存液轉(zhuǎn)入裝有8.5 mL CD CHO培養(yǎng)基的離心管中，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清。將細(xì)胞沉淀重新懸浮于5 mL CD CHO培養(yǎng)基中，以0.30×106個(gè)/mL～0.90×106個(gè)/mL的密度接種于裝有25 mL CD CHO培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。將三角瓶置于CO2搖床中培養(yǎng)，CO2濃度、溫度和轉(zhuǎn)速分別為6%、36.5 ℃和130 r/min。每三天對(duì)搖瓶中的細(xì)胞計(jì)數(shù)一次，按(0.4×106～0.6×106)個(gè)/mL的密度接種至新鮮培養(yǎng)基，逐級(jí)傳代擴(kuò)增至0.25 L～2 L搖瓶中。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將細(xì)胞按一定的接種細(xì)胞密度接入250 mL擋板搖瓶中，接種體積80 mL，搖床培養(yǎng)參數(shù)為：6% CO2，36.5 ℃，130 r/min。其他工藝參數(shù)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)定。按相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料體積為初始培養(yǎng)重量的4%，外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時(shí)，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據(jù)通氣產(chǎn)生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.3.33 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將搖瓶種子細(xì)胞按一定比例稀釋至接種細(xì)胞密度設(shè)定值，接入3 L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐初始培養(yǎng)體積1.0 L。設(shè)置發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為280 r/min，DO設(shè)定值為40%，與O2通氣量進(jìn)行關(guān)聯(lián)控制，氧氣通氣流量范圍為(0～500) mL/min，根據(jù)活細(xì)胞密度調(diào)整空氣流量設(shè)定值，空氣流量控制范圍為(10～100) mL/min。其他工藝參數(shù)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)定。pH通過(guò)添加通碳酸氫鈉溶液和CO2進(jìn)行關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)。每天取樣檢測(cè)活細(xì)胞密度、細(xì)胞活率，第3 d、5 d、7 d、9 d、11 d補(bǔ)料，補(bǔ)料體積為初始培養(yǎng)重量的4%，外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時(shí)，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據(jù)通氣產(chǎn)生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1VEGF-MA濃度檢測(cè)

VEGF-MA濃度檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.4.2VEGF-MA純化

VEGF-MA純化方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12,13]。

1.4.3糖基化水平檢測(cè)

糖基化水平檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14-16]。

1.4.4蛋白純度檢測(cè)

蛋白純度檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14-16]。

1.4.5電荷異質(zhì)性檢測(cè)

電荷異質(zhì)性檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14-16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化

首先選取14種細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，種類如表1所示。分別在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細(xì)胞，考察抗VEGF抗體的生產(chǎn)性能，目的在于選擇最優(yōu)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。目的蛋白產(chǎn)量是體現(xiàn)生產(chǎn)性能的主要指標(biāo)，在上述14種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細(xì)胞7 d后，發(fā)酵液中的VEGF-MA濃度如圖1所示。從中可以看出，最優(yōu)的批次所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為5#，VEGF-MA的產(chǎn)量為0.70 g/L。此外，使用7#、9#和11#三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，也可以獲得較高的目的蛋白產(chǎn)量(0.60 g/L以上)。除目的蛋白產(chǎn)量外，目的產(chǎn)物質(zhì)量也是體現(xiàn)生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)。目的產(chǎn)物質(zhì)量可以依靠其電荷異質(zhì)性、糖基化組分和蛋白純度三個(gè)指標(biāo)判斷。通常情況下，電荷異質(zhì)性≤35.0%、糖基化組分處于50.0%～60.0%之間以及蛋白純度≥85.0%的目的產(chǎn)物被認(rèn)為質(zhì)量合格。在上述14個(gè)批次結(jié)束時(shí)刻的發(fā)酵液中分離純化抗VEGF抗體，測(cè)定其電荷異質(zhì)性、糖基化組分和蛋白純度，結(jié)果如表4所示?？梢钥闯?，5#基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA質(zhì)量較高。綜合目的產(chǎn)物產(chǎn)量及質(zhì)量，選用5#培養(yǎng)基，即ActiCHO P Powder CD，作為后續(xù)研究中所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.1.2補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化

選取如表2所示的10種補(bǔ)料培養(yǎng)基，在使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下，按照1.3.2小節(jié)所述的方法進(jìn)行補(bǔ)料操作，以篩選最優(yōu)的補(bǔ)料培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量分別如圖2和表5所示。綜合考慮VEGF-MA的產(chǎn)量和質(zhì)量，選取8#補(bǔ)料培養(yǎng)基，即CD Efficient Feed C AG，作為后續(xù)研究中使用的補(bǔ)料培養(yǎng)基。補(bǔ)加CD Efficient Feed C AG后，對(duì)目的產(chǎn)物質(zhì)量影響不明顯，且VEGF-MA的產(chǎn)量達(dá)到2.55 g/L。

圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

圖2 添加不同補(bǔ)料培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表4 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基下的VEGF-MA質(zhì)量

表5 添加不同補(bǔ)料培養(yǎng)條件基下的VEGF-MA質(zhì)量

2.1.3外源添加物優(yōu)化

選取如表3所示的7種外源添加物，考察在補(bǔ)加不同外源添加物條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能。在使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基和CD Efficient Feed C AG補(bǔ)料培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)14 d后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量分別如圖3和表6所示。從中可以看出，添加各種外源添加物條件下，VEGF-MA產(chǎn)量均有不同程度的提高。綜合考慮VEGF-MA的產(chǎn)量和質(zhì)量，選取1#外源添加物，即Sheff-CHO Plus PF ACF。添加該物質(zhì)后，對(duì)目的產(chǎn)物質(zhì)量影響不明顯，且VEGF-MA產(chǎn)量由2.54 g/L提高至3.20 g/L。

表6 補(bǔ)加不同外源添加物條件下的VEGF-MA質(zhì)量

圖3 補(bǔ)加不同外源添加物條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

2.2 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1接種密度優(yōu)化

將上述研究中所獲得的培養(yǎng)基組合用于3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)VEGF-MA的過(guò)程，即使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基CD Efficient Feed C AG補(bǔ)料培養(yǎng)基，并添加Sheff-CHO Plus PF ACF。共進(jìn)行三個(gè)批次的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)14 d后VEGF-MA產(chǎn)量均在3.20 g/L左右(圖4)，且VEGF-MA電荷異質(zhì)性、糖基化水平和蛋白純度均達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(表7)。在后續(xù)的研究中，將以這三個(gè)批次作為對(duì)照，在3 L發(fā)酵罐中對(duì)接種密度、pH、溶解氧濃度(DO)、前期培養(yǎng)溫度和后期培養(yǎng)溫度做進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表7 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA質(zhì)量

首先優(yōu)化接種密度，分別考察0.7×106個(gè)/mL、1.0×106個(gè)/mL和1.3×106個(gè)/mL三個(gè)接種密度條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能，VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖5和表8所示?？梢钥闯鼋臃N密度對(duì)VEGF-MA產(chǎn)量、電荷 異質(zhì)性、糖基化水平和VEGF-MA純度均沒(méi)有顯著影響。因此，在后續(xù)研究中，仍然使用1.0×106個(gè)/mL的接種密度。

圖5 不同接種密度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表8 不同接種密度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

2.2.2pH優(yōu)化

對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的pH進(jìn)行優(yōu)化，分別考察pH設(shè)定為7.00(對(duì)照)、7.10和7.15條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能，VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖6和表9所示。pH設(shè)定為7.10時(shí)VEGF-MA產(chǎn)量最高，達(dá)到表達(dá)量3.70 g/L。此時(shí)的電荷異質(zhì)性、糖基化水平和VEGF-MA均處在標(biāo)準(zhǔn)的范圍內(nèi)。因此，在后續(xù)的研究中都將選用7.10作為pH的設(shè)定值。

圖6 不同pH條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表9 不同pH條件下的VEGF-MA質(zhì)量

2.2.3DO優(yōu)化

對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的DO進(jìn)行優(yōu)化，分別考察DO為20%(對(duì)照)、40%和80%條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能，VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖7和表10所示。從中可以看出，DO對(duì)VEGF-MA產(chǎn)量、蛋白異質(zhì)性和糖基化水平并無(wú)顯著影響，但DO為40%時(shí)VEGF-MA純度最高。因此，在后續(xù)的研究中，均使用40%的DO水平。

圖7 不同DO條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表10 不同DO條件下的VEGF-MA質(zhì)量

2.2.4前期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

在培養(yǎng)CHO細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的過(guò)程中，培養(yǎng)前期通常采用較高的溫度，而在培養(yǎng)后期適當(dāng)降溫，本研究首先對(duì)培養(yǎng)前期的溫度進(jìn)行優(yōu)化?？疾炫囵B(yǎng)前期溫度分別為36.0 ℃(對(duì)照)、36.5 ℃和37.0 ℃條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能，結(jié)果如圖8和表11所示。36.5 ℃條件下，VEGF-MA濃度和純度分別為3.26 g/L和96.6%，均高于其他兩個(gè)批次。因此，在后續(xù)的研究中將繼續(xù)采用36.5 ℃的前期培養(yǎng)溫度。

圖8 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表11 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

2.2.5后期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

對(duì)培養(yǎng)后期的溫度進(jìn)行優(yōu)化?？疾炫囵B(yǎng)后期溫度分別為32.0 ℃、33.0 ℃(對(duì)照)和34.0 ℃條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能，結(jié)果如圖9和表12所示。后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃時(shí)能夠獲得最高的VEGF-MA產(chǎn)量(4.10 g/L)，而此時(shí)的VEGF-MA質(zhì)量也能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。因此可以確定，最佳的后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃。

圖9 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

表12 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

3 結(jié)論

(1) 培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)VEGF-MA的最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基和外源添加物分別為ActiCHO P Powder CD、CD Efficient Feed C AG和Sheff-CHO Plus PF ACF。在此條件下的VEGF-MA的產(chǎn)量為3.20 g/L。

(2) 3 L發(fā)酵罐下的最優(yōu)培養(yǎng)條件：接種密度為1.0×106個(gè)/mL、pH為 7.10、溶解氧濃度為40%、前期培養(yǎng)溫度為36.5 ℃、后期培養(yǎng)溫度為34 ℃。在此條件下VEGF-MA的產(chǎn)量能夠達(dá)到4.10 g/L的較高水平，且VEGF-MA質(zhì)量較高。