崔文會，孫 雪，梁承宇，袁曉明，李保國*，劉 莉*

1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093;2.中國科學院上海高等研究院，上海 201210;3.光明食品集團上海崇明農場有限公司，上海 202179

近年來我國農作物的土傳病害日趨嚴重，對農作物的產量和品質造成了嚴重的影響。土傳病害是指由存在于土壤中的病原物在條件適宜時侵染植物根部或莖部而造成的病害。土傳病害的致病菌棲息于土壤中，難以根治，甚至被稱為植物癌癥[1]。土傳病原體的類型包括真菌、細菌和線蟲等，引發(fā)包括紋枯、枯萎、立枯、猝倒、根腐、軟腐、根腫和叢根等類型病害[2]。與細菌、線蟲等類型引起的土傳病害相比，土傳真菌病害更易于傳播，涉及作物類型廣泛，對作物產量危害極大[3]。據估計植物病害造成的直接經濟損失中的70%～80%是病原真菌的侵染所引起，當前全球范圍內每年因真菌引起的作物病害導致糧食減產1.25億噸，造成上千億美元的經濟損失。對以人口眾多、農業(yè)為主的發(fā)展中國家影響更為嚴重，不僅導致作物減產、環(huán)境破壞、生態(tài)失衡和經濟損失，還嚴重影響人類的可持續(xù)發(fā)展[4]。

目前，國內外通常采用物理、化學及生物方法防治植物病害。物理防治費時費力，且防治效果有限、受環(huán)境條件影響較大，因此應用受到限制；化學防治由于其使用方便、效果明顯而被廣泛使用，但長期大量使用化學藥劑會使病害產生抗藥性，造成環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡，且存在農藥殘留，對人畜副作用大[5]；生物防治與其它方法相比，具有安全、有效和持久的特點，特別是避免了化學防治帶來的一系列問題，近年來備受關注。因此，更好地利用有益微生物防治植物病害是目前最為切實可行的策略之一。生物防治是利用活體生防菌株及其代謝的活性成分來控制病害發(fā)生的一種技術，生防菌株可在作物植株及根際定植生長，形成生物屏障保護作物免受病原菌侵害；其代謝活性物質一方面抑制殺死病原真菌，另一方面誘導植株提高病害抗性，菌株所分解和轉化的營養(yǎng)元素又可以被作物加以利用，進而提高作物品質、增加產量[6]。目前多數研究集中在某單一作物的土傳真菌病害的生物防治上，針對引起多種作物土傳真菌病害的報道較少。本研究針對3種主要糧食作物的常見土傳病害，旨在篩選出能夠拮抗不同類型土傳真菌病害的廣譜生防菌株，為主要糧食作物土傳真菌病害生防菌劑的開發(fā)和應用奠定基礎。因生物防治是利用活體生防菌株及其代謝產物的活性成分來控制病害的發(fā)生，因此需要對生防菌株的活性物質進行探究，包括抑菌活性物質的種類和其抑菌活性的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

指示病原真菌:水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)由海南大學熱帶農林學院農藥實驗室提供；水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由吉林省農業(yè)科學院植物保護研究所提供；大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH為7.0。固體培養(yǎng)基時另添加15 g/L～20 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基時另添加15 g/L～20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

AxyPrep基因組提取試劑盒、Taq酶、DNA Ladder Mix、dNTP 均購自上海生工生物工程股份有限公司；其余試劑均為上海國藥集團化學試劑有限公司的分析純試劑。

全自動電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；分光光度計：德國BECKMAN COULTER公司；電子天平：德國Sartorius公司；高壓蒸汽滅菌器：日本三洋公司；S1000-PCR擴增儀：美國BIO-RAD；ZWY-2102C恒溫振蕩搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；L550醫(yī)用離心機：湖南湘儀實驗室儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1拮抗微生物的分離純化

采用五點取樣法，在崇明稻田土壤靠近植株根系部，去除表層0 cm～5 cm的表土，采集5 cm～20 cm土壤剖面，混勻后取1 kg，收集了15份土樣，裝入無菌塑料袋帶回，4 ℃冰箱保存。

每份土樣稱取10 g，置于三角錐形瓶中，加入90 mL滅菌水和少許滅菌玻璃珠，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)20 min，室溫靜置20 min，將土壤中的微生物分離出來，此為10-1土壤懸液。吸取1 mL 10-1土壤懸液于9 mL無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次，混勻，制成10-2土壤懸液[7]。以此類推依次制成10-3～10-8不同稀釋度的土壤懸液。吸取100 μL不同濃度梯度的土壤懸浮液均勻涂布在LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h～72 h后，根據菌落大小、顏色、邊緣光滑程度等形態(tài)學特征對細菌進行分離純化得到單菌落。

1.3.2拮抗微生物的篩選

抗菌活性用平板對峙法[8]測定。將6種病原菌進行活化培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔制成直徑為6 mm的病原菌菌餅，放置到PDA平板中央，同時將分離得到的單菌落點接在距離平板中心25 mm處，每皿接種4個菌株，以只放置病原菌菌餅的PDA平板作為對照，重復3次，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對照組中的病原菌菌絲長滿培養(yǎng)基，觀察實驗組平板上是否出現(xiàn)拮抗帶，測量相對拮抗菌方向病原菌菌絲生長的直徑(D)和抑菌帶寬度(d)，利用公式(1)計算抑菌率。

抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

(1)

1.3.3拮抗微生物的鑒定

1.3.3.1形態(tài)學觀察

首先將CX-2菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)特征。挑取培養(yǎng)基上的菌落進行革蘭氏染色[9]，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)特征。

1.3.3.2生理生化特性鑒定

生理生化測定參照《伯杰氏細菌學鑒定手冊》[10]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。

1.3.3.3分子生物學鑒定

將篩選到的菌株采用16S rDNA基因序列分析的方法進行鑒定，本實驗使用AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒，提取相關的原核微生物基因組，擴增引物對使用27F(5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)，PCR反應體系為：Taq酶10 μL，模板1 μL，引物各0.5 μL，補ddH2O至20 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，以上循環(huán)進行30次，72 ℃補延伸10 min，最后16 ℃降溫5 min結束。

PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測條帶后，由上海生工生物工程股份有限公司純化測序。根據基因測序結果，采用BLAST搜索程序從GenBank數據庫中調出同源性高的相關菌株的基因序列，利用MEGA 7.0軟件進行序列多重比對后，采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹，從而確定菌株CX-2的分類。

1.3.4無菌濾液的抑菌活性

CX-2菌株無菌濾液的制備：將菌株轉接到裝有5 mL液體LB的試管中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，吸取3 mL菌液，移入裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)96 h，然后將上述發(fā)酵液10 000 r/min下離心15 min，取離心后的上清液，用孔徑為0.22 μm的細菌過濾器過濾，得到無菌濾液，用以驗證CX-2菌株無菌濾液的抑菌活性。

無菌濾液抑菌效果的測定采用菌絲生長速率法[12]。吸取100 μL無菌濾液均勻涂布于PDA平板上，然后在平板中心放置直徑為6 mm的病原菌菌餅，對照組涂布等體積的無菌水后放置相同直徑的病原菌菌餅，重復3次，5 d后觀察并記錄對照組和實驗組病原菌菌餅的直徑大小，并計算抑菌率。

1.3.5揮發(fā)性氣體的抑菌活性

采用平板倒扣法[13]測定揮發(fā)性氣體的抑菌活性，將直徑6 mm的病原菌菌餅放置在PDA培養(yǎng)基平板中央。取100 μL CX-2菌株的發(fā)酵液在LB培養(yǎng)基平板上均勻涂布，然后將兩平板對扣，封口膜密封，用100 μL無菌水替代菌株發(fā)酵液作為對照組，每個處理設3個重復。5 d后觀察病原菌菌絲的生長情況并測量病原菌菌餅直徑，計算抑菌率。

1.3.6無菌濾液的穩(wěn)定性

1.3.6.1無菌濾液的熱穩(wěn)定性

將制備好的無菌濾液分別在不同溫度下處理1 h，溫度恢復至室溫25 ℃后，用菌絲生長速率法，測定無菌濾液對水稻稻瘟病菌的抑菌活性[14]，吸取100 μL經過不同溫度處理的無菌濾液均勻涂布于PDA平板上，然后在平板中心放置直徑為6 mm的病原菌菌餅。對照組(T=25 ℃)涂布等體積的無菌水后放置相同直徑的病原菌菌餅，重復3次，5 d后觀察并記錄對照組和實驗組病原菌菌餅的直徑大小，計算抑菌率。

1.3.6.2無菌濾液的酸堿穩(wěn)定性

用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調節(jié)無菌濾液的pH為2～12，靜置24 h后調回原發(fā)酵液的pH 6.4備用[14]。測定不同酸堿度處理后無菌濾液對水稻稻瘟病菌的抑菌活性，以未調整pH(6.4)的無菌發(fā)酵液為空白對照，重復3次，計算抑菌率。

1.3.6.3無菌濾液對蛋白酶K的穩(wěn)定性

為了對無菌濾液中抑菌活性物質的種類進行初步探究，在菌株CX-2的無菌濾液中加入蛋白酶K，使酶的最終濃度為1 mg/mL，37 ℃處理1 h，測定處理后無菌濾液對水稻稻瘟病菌的抑菌活性[14]，以不加入酶的無菌濾液作為空白對照，重復3次，計算抑菌率。

1.3.7數據處理與分析

采用Origin 8.5軟件和Excel 2016對數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

通過平板對峙實驗，從土壤樣品中共分離得到5株對所選6種病原真菌均表現(xiàn)出拮抗效果的菌株，菌株編號分別為CX-2、SJK-2、SJK-3、JK-1、XL-1。抑菌效果見表1。由表1可看出，CX-2菌株對6種病原真菌表現(xiàn)出的效果最好，尤其是對小麥紋枯病菌和小麥全蝕病菌的抑菌率高達80%以上，分別為81.71%和91.27%。

表1 5株拮抗菌對6種土傳病原真菌的抑菌活性

選取CX-2菌株進行后續(xù)研究，對該菌株的抑菌活性物質和抑菌活性物質的穩(wěn)定性進行進一步探究。

圖1為CX-2菌株對6種病原真菌的平板對峙抑菌效果，從圖1中可以看出CX-2菌株對6種病原真菌的菌絲生長均有抑制效果，產生了清晰可見的抑菌帶。

A和a：水稻稻瘟病菌；B和b：水稻紋枯病菌；C和c：小麥赤霉病菌；D和d：小麥紋枯病菌；E和e：小麥全蝕病菌；F和f：大豆疫霉病菌。
其中A、B、C、D、E、F為對照組；a、b、c、d、e、f為實驗組。
圖1 CX-2對6種供試植物病原真菌的抑制效果

2.2 CX-2菌株分類鑒定

2.2.1形態(tài)學鑒定

拮抗菌CX-2在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形，表面及邊緣粗糙，呈乳白色，蠟狀(圖2A)。革蘭氏染色顯示該菌體為陽性桿狀菌株(圖2B)，且能產生芽孢(圖2C)。

2.2.2生理生化特性鑒定

菌株CX-2的生理生化特性表現(xiàn)為可以利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖，不產生H2S、能分泌明膠酶、V-P反應和吲哚試驗均呈陽性、甲基紅試驗呈陰性，能與硝酸鹽產生還原反應、可水解淀粉，接觸酶試驗和氧化酶試驗均呈陽性(表2所示)。其特征符合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中關于芽孢桿菌屬細菌的描述。

表2 菌株CX-2的生理生化特征

2.2.3分子生物學鑒定

CX-2菌株16S rDNA基因PCR擴增測序后得到長度為1 452 bp的片段，與GenBank中序列在線比對，與多株貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis16S rDNA序列的同源性高達99%以上，與MK310268、MG727659等B.velezensis的親緣關系最近，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支(見圖3)?；诜肿由飳W鑒定結果，結合形態(tài)學和生理生化特性，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis。

圖3 CX-2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 無菌濾液的抑菌活性

CX-2無菌濾液對6種病原真菌抑菌率如表3所示，CX-2的無菌濾液能夠發(fā)揮很好的抑制作用，對全部6種病原真菌的抑制率達到了71%以上，對小麥紋枯病菌和小麥全蝕病原菌的抑菌率分別為90.13%和94.34%。說明CX-2菌株的無菌濾液中含有抗菌活性物質，從而起到對病原菌的抑制作用。

表3 CX-2無菌濾液對6種土傳病原真菌的抑菌效果

2.4 揮發(fā)性氣體的抑菌效果

CX-2菌株產生的揮發(fā)性物質對6種病原菌的抑制效果如表4所示，由表4可以看出，CX-2菌株所產生的揮發(fā)性物質對全部6種病原真菌的抑菌率集中在45%～77%之間，對大豆疫霉病菌發(fā)揮最大的抑菌效果，抑菌率為76.62%。由此推測，CX-2菌株所產生的揮發(fā)性氣體中含有抑菌活性物質，可以對6種病原菌起到抑制作用。

2.5 無菌濾液的穩(wěn)定性

2.5.1無菌濾液的熱穩(wěn)定性

無菌濾液經過不同溫度處理后對水稻稻瘟病菌的抑菌率變化情況見圖4，與對照組(T=25 ℃)的抑菌活性相比無明顯差異。經4 ℃低溫處理與40 ℃～100 ℃高溫處理后，對水稻稻瘟病菌的抑菌率都略有降低，但抑菌率仍維持在50%以上，表明無菌濾液中的抗菌活性物質具有較強的熱穩(wěn)定性。

表4 CX-2揮發(fā)性氣體對6種土傳病原真菌的抑菌效果

圖4 溫度對無菌濾液活性的影響

2.5.2無菌濾液的酸堿穩(wěn)定性

對pH為6.4的原始無菌濾液進行酸、堿調節(jié)后，其對水稻稻瘟病菌的抑菌活性如圖5所示，由圖5可以看出，CX-2的無菌濾液在pH為5～9時表現(xiàn)出較高的抑菌活性，當pH為2、3及11、12時，無菌濾液喪失了對水稻稻瘟病菌的拮抗活性，說明較低或較高的pH會破壞無菌濾液中抗菌活性物質的抑菌活性，由此可知，理想發(fā)酵液的pH應維持在5～9之間。

2.5.3無菌濾液對蛋白酶K的穩(wěn)定性

室溫下未經蛋白酶K處理的無菌濾液對水稻稻瘟病菌的抑菌率為71.24%，經蛋白酶K處理1 h后，對水稻稻瘟病菌的抑菌率為70.79%，與對照組相比，抑菌活性沒有明顯的降低，說明無菌濾液中的抑菌活性物質對蛋白酶K不敏感，CX-2菌株的抗菌活性物質可能為非蛋白類物質。

3 結論

本研究從土壤中分離獲得一株對所選6種病原真菌均有拮抗效果的菌株，通過對菌株的形態(tài)、生理生化特性及分子生物學特征分析研究，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis。在平板對峙實驗中，CX-2菌株對全部6種病原真菌均有抑制作用，其抑菌活性具有廣譜性。另外CX-2菌株的無菌濾液和揮發(fā)性氣體均有一定的抑菌效果，說明菌株CX-2的無菌濾液和揮發(fā)性氣體中存在抗菌活性物質，其中無菌濾液對全部6種病原真菌的抑制率達到了71%以上，對小麥紋枯病菌和小麥全蝕病原菌的抑菌率均在90%以上，分別為90.13%和94.34%；CX-2菌株所產生的揮發(fā)性物質對大豆疫霉病菌發(fā)揮最大的抑菌效果，抑菌率為76.62%。而且無菌濾液的熱穩(wěn)定性好；其pH在5～9之間時可以發(fā)揮穩(wěn)定的抑菌活性；另外無菌濾液對蛋白酶K的穩(wěn)定性良好。綜上所述，本研究篩選獲得的貝萊斯芽孢桿菌BacillusvelezensisCX-2，其活菌、無菌濾液和所產生的揮發(fā)性氣體均對所選6種病原菌具有拮抗活性，抑菌活性物質可能為非蛋白類物質，無菌濾液抑菌活性穩(wěn)定，可用于防治引起水稻、小麥和大豆常見土傳病害的生物防治，具有開發(fā)成生防菌劑的潛力。

備注：“**”代表無抑菌活性

圖5 pH對無菌濾液活性的影響