王 桃，紀(jì) 瑞，劉海燕，李忠磊，陳代杰,3*，譚 俊*

1. 上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200234； 2. 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院， 上海 201203；3. 上海交通大學(xué) 藥學(xué)院， 上海 200240

雙歧桿菌是一類嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌[1]，是人體腸道內(nèi)重要的益生菌群，在成年人的腸道中約占腸道總菌數(shù)的3%～10%，而在嬰兒的腸道占到91%以上[2]，是腸黏膜屏障中生物屏障的主要成分，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂等方面都發(fā)揮著重要的作用，其益生作用已得到社會(huì)的公認(rèn)[3]。

隨著年齡的增長(zhǎng)，人體腸道內(nèi)致病菌數(shù)量逐漸增加，益生菌數(shù)量逐漸減少，其中雙歧桿菌的數(shù)量減少最為明顯，從而引起腸道內(nèi)微生態(tài)平衡的破壞，導(dǎo)致疾病發(fā)生，研究證實(shí)，可通過(guò)口服含有一定數(shù)量雙歧桿菌的活菌制劑來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡[4]。美國(guó)FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限為1.0×106CFU/g[5]，也就是說(shuō)雙歧桿菌必須是“足量的”、“有活性的”才能發(fā)揮作用，然而雙歧桿菌制品普遍存在著不能常溫保存、保質(zhì)期短等缺陷[6]，使其作用發(fā)揮和應(yīng)用受限，因此，雙歧桿菌活菌制劑的制備及儲(chǔ)存穩(wěn)定性研究十分重要。

提高雙歧桿菌穩(wěn)定性的常用技術(shù)主要有代謝調(diào)控技術(shù)、真空冷凍干燥技術(shù)和微膠囊技術(shù)[7]。本文主要采用真空冷凍干燥技術(shù)來(lái)制備雙歧桿菌活菌制劑。與冷凍產(chǎn)品以及液態(tài)雙歧桿菌制劑相比，凍干菌粉易于處理并且活菌保存期較長(zhǎng)[8-10]，但在凍干的過(guò)程中，細(xì)菌會(huì)因滲透休克、形成胞內(nèi)冰晶和再結(jié)晶而造成細(xì)胞膜損傷[11]，導(dǎo)致細(xì)菌的凍干存活率降低，因此需要利用凍干保護(hù)劑來(lái)減少菌體的活性損失。通常選用的凍干保護(hù)劑為可溶性物質(zhì)[12]，如海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉等。本文以長(zhǎng)雙歧桿菌DD98為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化，提高凍干菌粉的活菌數(shù)；通過(guò)菌粉的保存穩(wěn)定性考察，進(jìn)一步證實(shí)該保護(hù)劑配方不僅適用于4 ℃低溫保藏24個(gè)月，還可在室溫25 ℃保藏至少12個(gè)月，活菌數(shù)都能達(dá)到美國(guó)FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限1.0×106CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)。常溫保存不僅具有大大降低運(yùn)輸成本的優(yōu)勢(shì)，還更加適合胃腸道不適的人群直接飲用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)DD98，本實(shí)驗(yàn)室專利菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

BBL固體培養(yǎng)基：蛋白胨15 g，葡萄糖20 g，氯化鈉5 g，酵母浸粉2 g，番茄浸粉5 g，可溶性淀粉0.5 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，肝浸粉2 g，吐溫801 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0±0.1，115 ℃滅菌20 min。

RCM(改良)培養(yǎng)基：蛋白胨FP103 17 g，酵母浸粉FM405 16 g，葡萄糖(一水)22 g，氯化鈉5 g，無(wú)水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽(一水)0.55 g，低聚果糖4 g，純化水1 000 mL，pH 6.8±0.1，121 ℃滅菌20 min。

RCM(改良)種子培養(yǎng)基：蛋白胨FP103 3 g，酵母浸粉FM405 12.5 g，葡萄糖(一水)6 g，氯化鈉5 g，無(wú)水乙酸鈉3 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽(一水)0.55 g，純化水1 000 mL，pH 6.8±0.1，121 ℃滅菌20 min。

茄子瓶斜面培養(yǎng)基：在RCM種子培養(yǎng)基中加入2.5%(w/v)的瓊脂。

1.1.3保護(hù)劑

海藻糖，來(lái)源于日本林原；葡萄糖，來(lái)源于西王藥業(yè)有限公司；水蘇糖，來(lái)源于江蘇恒惠食品有限公司；蔗糖，來(lái)源于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳糖，來(lái)源于河南興源化工產(chǎn)品有限公司；甘露醇，來(lái)源于河南興源化工產(chǎn)品有限公司；乳果糖，河南興源化工產(chǎn)品有限公司；脫脂奶粉，來(lái)源于新西蘭乳品(中國(guó))有限公司；Vc-Na，來(lái)源于石藥集團(tuán)維生藥業(yè)；谷氨酸鈉，來(lái)源于加加食品集團(tuán)股份有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，來(lái)源于河南盛之德商貿(mào)有限公司。將所有的試劑按要求配制溶解后的溶液115 ℃滅菌15 min冷卻后備用。

1.1.4儀器

超低溫冰箱FermoTM900，美國(guó)Thermo Scientific；超凈工作臺(tái)ZHJH-C1112B，上海智城分析儀器公司；立式高壓滅菌鍋LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；7 L發(fā)酵罐7GB，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。酶標(biāo)儀Multiskan Go，美國(guó)Thermo Scientific；冷凍干燥機(jī)LGJ-22D，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；恒溫恒濕箱ICH2，德國(guó)美墨爾特。

1.2 方法

1.2.1雙歧桿菌DD98菌粉制備

雙歧桿菌DD98菌粉的制備采用二級(jí)發(fā)酵，具體流程如圖1。

圖1 雙歧桿菌DD98菌粉制備流程圖

將本實(shí)驗(yàn)室保存在-80 ℃超低溫冰箱中的DD98菌株甘油管取出，放置37 ℃水浴鍋中使其快速融化后，取200 μL接入茄子瓶斜面中，用接種鏟將菌液涂勻后置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃連續(xù)培養(yǎng)24 h，然后將茄子瓶斜面的菌苔刮出，轉(zhuǎn)移到300 mL液體培養(yǎng)基中，搖勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后將300 mL種子液轉(zhuǎn)接到7 L發(fā)酵罐進(jìn)行38℃厭氧培養(yǎng)，接種前培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.5。待菌生長(zhǎng)成熟后放罐，收集菌液用離心機(jī)進(jìn)行離心，9 900 r/min，離心5 min。將離心后的菌泥加入凍干保護(hù)劑，充分混合均勻，用冷凍干燥機(jī)凍干，獲得菌粉。

1.2.2菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

將長(zhǎng)雙歧桿菌DD98接新鮮斜面，于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，將斜面洗下至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置在厭氧培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3凍干保護(hù)劑的篩選

脫脂奶粉添加量的篩選：分別稱取脫脂奶粉0 g、2.5 g、5 g、7.5 g和10 g置于100 mL燒杯中，加入20 mL去離子水，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枞芙夂?，?50 mL容量瓶中進(jìn)行定容，分別配制成0%、5%、10%、15%和20%的脫脂奶粉溶液。115 ℃滅菌15 min，然后將其與菌泥質(zhì)量比1∶1混勻進(jìn)行凍干，計(jì)算凍干存活率。

糖類保護(hù)劑的篩選：在確定了脫脂奶粉百分含量的基礎(chǔ)上，分別稱取葡萄糖、水蘇糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、乳果糖配成10%的溶液，115 ℃滅菌15 min。然后將其與菌泥質(zhì)量比1∶1混勻進(jìn)行凍干，計(jì)算凍干存活率。篩選出糖類保護(hù)劑之后，再對(duì)其添加量進(jìn)行篩選，方法與脫脂奶粉添加量的篩選方法一致。

抗氧化劑的篩選：在確定了脫脂奶粉百分含量和糖類保護(hù)劑的基礎(chǔ)上，分別稱取Vc-Na、谷氨酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽配成1%的溶液，115 ℃滅菌15 min。然后將其與菌泥質(zhì)量比1∶1混勻進(jìn)行凍干，計(jì)算凍干存活率。篩選出抗氧化劑之后，再對(duì)其添加量進(jìn)行篩選，方法與脫脂奶粉添加量的篩選方法一致。

1.2.4保護(hù)劑與菌泥混合質(zhì)量比優(yōu)化

將菌泥與優(yōu)化后的保護(hù)劑分別按照1∶0.3、1∶0.6、1∶0.9、1∶1、1∶1.5的比例混合，充分混合均勻后，放在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，計(jì)算凍干存活率，選出最優(yōu)的質(zhì)量添加比。

1.2.5冷凍干燥

凍干工藝為：第一階段：-40 ℃，4 h預(yù)凍結(jié)束后抽真空；第二階段：5 ℃，10 h；第三階段：15 ℃，10 h，真空度為10 Pa，厚度約為0.5 cm。凍干結(jié)束后，取出凍干菌粉通過(guò)平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，計(jì)算凍干存活率。

1.2.6菌粉保存穩(wěn)定性

將加入凍干保護(hù)劑冷凍干燥后制得的菌粉每包稱取5 g充氮?dú)膺M(jìn)行密封包裝，然后將其隨機(jī)分成2組放在4 ℃、25 ℃恒溫恒濕箱中保存，分別在7 d、15 d、30 d、60 d、120 d、180 d、360 d、540 d和720 d取樣測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.7存活率的測(cè)定

樣品放在4 ℃、25 ℃保存，分別在7 d、15 d、30 d、60 d、120 d、180 d、360 d、540 d和720 d取出樣品依次梯度稀釋到10-9，涂BBL培養(yǎng)基，放在厭氧箱中37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。

存活率=V2/V1×100%

V1為保存/凍干前的總活菌數(shù)；V2為保存/凍干后的總活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌DD98的生長(zhǎng)曲線

長(zhǎng)雙歧桿菌DD98在搖瓶中的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，菌株在0 h～4 h處于延遲期，4 h后快速生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。12 h達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)菌體的數(shù)量最多，菌體的特性也較穩(wěn)定，可選擇此時(shí)將菌液轉(zhuǎn)接到7 L發(fā)酵罐中，進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵。

圖2 搖瓶生長(zhǎng)曲線

長(zhǎng)雙歧桿菌DD98在7 L罐發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線如圖3所示，在0 h～4 h處于延遲期，4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。10 h達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)菌體的數(shù)量最多，菌體的特性也較穩(wěn)定，可收集此時(shí)的菌體進(jìn)行后續(xù)的凍干保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)。

圖3 7 L罐生長(zhǎng)曲線

2.2 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

微生物在凍干的過(guò)程中會(huì)因?yàn)榧?xì)胞膜損傷而造成細(xì)菌死亡，活菌數(shù)下降。為了減少細(xì)菌的死亡，提高凍干菌粉的活菌數(shù)，就需要在微生物凍干時(shí)添加凍干保護(hù)劑。不同的微生物凍干所需要的最佳保護(hù)劑是不同的[13]，但主要都是脫脂奶粉、糖類保護(hù)劑、抗氧化劑這三種成分，所以針對(duì)這三種保護(hù)劑成分進(jìn)行篩選。

首先對(duì)脫脂奶粉的添加量進(jìn)行篩選，其篩選結(jié)果如圖4。從圖4可以看出，當(dāng)脫脂奶粉的添加量超過(guò)10%以上時(shí)，凍干存活率不再增加。脫脂奶粉的添加量為10%時(shí)，凍干存活率最高為35.7%，且與不加保護(hù)劑直接凍干的菌粉相比，其凍干存活率提高了10.7倍。

圖4 脫脂奶粉添加量篩選結(jié)果

在10%的脫脂奶粉的基礎(chǔ)上，對(duì)糖類保護(hù)劑進(jìn)行篩選。參考動(dòng)物雙歧桿菌和乳酸桿菌的保護(hù)劑成分[3]，各種糖分別配制成10%的溶液，其篩選結(jié)果如圖5。從圖5可以看出，采用海藻糖作為保護(hù)劑的凍干菌粉的凍干存活率最高，凍干存活率為48.1%，相比單純的10%脫脂奶粉，凍干存活率提高了12.4%。因此進(jìn)一步對(duì)海藻糖的添加比例進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果如圖6。從圖6可以看出，海藻糖的添加量為25%時(shí)，保護(hù)效果最好，但在實(shí)際操作中25%的海藻糖相對(duì)難分散，濃度過(guò)高，流動(dòng)性差，考慮到后續(xù)用凍干機(jī)進(jìn)行凍干的可操作性，選擇20%作為海藻糖的最優(yōu)添加比例。

圖5 糖類保護(hù)劑的篩選

圖6 海藻糖添加量篩選結(jié)果

參考動(dòng)物雙歧桿菌和乳酸桿菌的保護(hù)劑成分[3]，各抗氧化劑成分分別配制成1%濃度。在10%脫脂奶粉和20%海藻糖的基礎(chǔ)上對(duì)抗氧化劑進(jìn)行篩選，其篩選結(jié)果如圖7。由圖7可知，Vc-Na對(duì)雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果最好，因此進(jìn)一步對(duì)Vc-Na的添加比例進(jìn)行了篩選，其結(jié)果如圖8。Vc-Na的添加比例在2%～4%之間對(duì)雙歧桿菌的保護(hù)效果幾乎不存在差異，因此考慮成本等問(wèn)題，選擇2%的Vc-Na作為最優(yōu)的添加量。

圖7 抗氧化劑的篩選

通過(guò)實(shí)驗(yàn)凍干保護(hù)劑優(yōu)化后的配方為脫脂奶粉10%、海藻糖20%、Vc-Na 2%、純化水68%。保護(hù)劑與菌泥的質(zhì)量添加比為1∶1。凍干前稱取28 g菌泥測(cè)定其總活菌數(shù)為1.64×1012CFU，采用優(yōu)化后的配方對(duì)28 g菌泥進(jìn)行凍干，凍干后的菌粉總活菌數(shù)為1.4×1012CFU，其凍干存活率在85%以上，凍干菌粉活菌數(shù)為5.0×1010CFU/g。

圖8 Vc-Na添加量篩選結(jié)果

2.3 保護(hù)劑與菌泥混合質(zhì)量的最優(yōu)比例

保護(hù)劑添加量對(duì)菌體的保護(hù)作用是有影響的。因此要通過(guò)實(shí)驗(yàn)選出最優(yōu)的保護(hù)劑添加比例，從而最大效果的保護(hù)菌體，增加凍干菌粉的活菌數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9。通過(guò)圖9可知，菌泥與保護(hù)劑比例為1∶0.3時(shí)，由于保護(hù)劑的添加量較少，對(duì)于菌體的保護(hù)作用較差。而菌泥與保護(hù)劑的比例為1∶0.6、1∶0.9、1∶1、1∶1.5時(shí)，對(duì)菌體的保護(hù)作用都較好。但菌泥與保護(hù)劑的比例為1∶0.6時(shí)，保護(hù)劑對(duì)菌體的保護(hù)作用最好，凍干存活率為90.3%，凍干菌粉的活菌數(shù)為5.3×1010CFU/g。因此，在后續(xù)的菌體凍干過(guò)程中，菌泥與凍干保護(hù)劑的質(zhì)量比都為1∶0.6，以最大限度地提高菌粉的凍干存活率。

圖9 保護(hù)劑與菌泥混合質(zhì)量比優(yōu)化

2.4 菌粉的保存穩(wěn)定性研究

與冷凍產(chǎn)品和液態(tài)雙歧桿菌制劑相比，長(zhǎng)雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存條件和保存時(shí)間都具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)會(huì)隨著時(shí)間的推移而降低。FAO/WHO建議食品益生菌活菌數(shù)應(yīng)在(1.0×106～1.0×107)CFU/g以上，當(dāng)雙歧桿菌DD98凍干菌粉的活菌數(shù)低于此標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，就失去了其益生作用，所以有必要考察雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存穩(wěn)定性。

恒溫加速試驗(yàn)對(duì)于普通食品而言，是一種快捷有效的保質(zhì)期評(píng)價(jià)方法[14]，但是對(duì)于雙歧桿菌DD98凍干粉這種對(duì)溫度、濕度、氧氣等外界因素非常敏感的活性益生菌產(chǎn)品而言[15]，很明顯是不適用的。針對(duì)活性益生菌產(chǎn)品評(píng)價(jià)其保質(zhì)期，通常選用的方法是活性益生菌產(chǎn)品在哪種條件下貯存和售賣，就在哪種條件下觀察產(chǎn)品的穩(wěn)定性。根據(jù)長(zhǎng)雙歧桿菌DD98凍干菌粉的生產(chǎn)和保存條件，選擇在4 ℃和25 ℃條件下，考察其凍干菌粉的保存穩(wěn)定性，所用的實(shí)驗(yàn)材料為活菌數(shù)為5.3×1010CFU/g的菌粉。其研究結(jié)果如表1。

表1 儲(chǔ)藏溫度對(duì)菌粉中雙歧桿菌DD98存活率的影響

由表1可知，凍干的雙歧桿菌菌粉在4 ℃保存24個(gè)月后，活菌數(shù)仍在1.0×108CFU/g以上，在25 ℃保存下的穩(wěn)定性雖不如4℃保存，但可以保存12個(gè)月，雙歧桿菌的存活率仍在1.0×106CFU/g以上，符合FAO/WHO建議食品益生菌活菌數(shù)應(yīng)在(1.0×106～1.0×107)CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)，該優(yōu)化后的保護(hù)劑配方，非常有利于長(zhǎng)雙歧桿菌DD98凍干菌粉的保存。

3 結(jié)論

隨著人們對(duì)健康程度的重視，益生菌產(chǎn)品越來(lái)越受到人類的青睞，然而，益生菌產(chǎn)品的優(yōu)劣與其制備過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)，比如優(yōu)勢(shì)菌種的篩選，發(fā)酵過(guò)程，凍干過(guò)程，保存方法等息息相關(guān)，每一環(huán)節(jié)都要盡量減少活菌數(shù)的損失。本文主要針對(duì)益生菌活菌制劑的凍干及保存環(huán)節(jié)，以長(zhǎng)雙歧桿菌DD98為研究對(duì)象，優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方，提高凍干菌粉的活菌數(shù)，通過(guò)菌粉的保存穩(wěn)定性考察，證實(shí)該保護(hù)劑配方不僅大幅度提高了菌體的凍干存活率，還可使凍干菌粉在4 ℃低溫保藏24個(gè)月，在室溫25 ℃可保藏12個(gè)月，活菌數(shù)都能達(dá)到美國(guó)FDA推薦食品中活性雙歧桿菌的添加量最低限1.0×106CFU/g的標(biāo)準(zhǔn)，為雙歧桿菌DD98菌粉工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。