農(nóng)雪娟，金佳熹，周冰玉，張麗鳳，洪劍威，趙爽

1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西百色市 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，a臨床醫(yī)學(xué)院；b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色市 533000

目前全球約有7000萬癲癇患者，90%生活在發(fā)展中國家[1]，近一半患者存在認(rèn)知功能特別是學(xué)習(xí)記憶功能障礙，嚴(yán)重影響癲癇患者的生活質(zhì)量[2]。如何改善癲癇后學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知受損已成為當(dāng)前腦科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。既往研究證實(shí)，靈芝孢子主要成分靈芝三萜具有抗氧化、提高免疫力、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用，同時(shí)具有一定程度的抗癲癇作用[3-5]。靈芝的主要化學(xué)和藥效成分為三萜類靈芝酸。外源性單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(monosialoteterahexosyl ganglioside,GM1)對神經(jīng)受損修復(fù)、再生有重大促進(jìn)作用[6-8]。本研究利用靈芝三萜聯(lián)合GM1對戊四氮致癇腦損傷后與突觸生長重塑密切相關(guān)的肌動蛋白結(jié)合蛋白(actinbinding protein,Cofilin)、突觸素(synaptophysin,SYN)、神經(jīng)生長相關(guān)蛋白43 (growth-associated protein 43,GAP-43)等基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，從而進(jìn)一步探討癲癇的發(fā)病機(jī)制和靈芝藥效成分的抗癇機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠75只，體質(zhì)量(200±20) g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[SCXK(湘)2014-0011]。動物飼養(yǎng)在右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(桂)2017-0004]，對實(shí)驗(yàn)動物的操作處理符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和動物3R原則，均已經(jīng)過右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有動物按自然晝夜，普通環(huán)境飼養(yǎng)，室溫(25±1)℃，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器

戊四氮：美國SⅠGMA公司。GM1注射液：齊魯制藥有限公司。靈芝三萜化合物(三萜含量249 g/kg)：廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司。AxyPrep總RNA小量制備試劑盒：美國AXYGEN公司。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：賽默飛科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master：瑞士羅氏公司。Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA PCR引物合成：生工生物工程(上海)股份有限公司。ABⅠ7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀：美國ABⅠ公司。HT7700透射電子顯微鏡：日本HⅠTACHⅠ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組及處理

將實(shí)驗(yàn)動物分為空白對照組、癲癇模型組、靈芝三萜組、GM1組和靈芝三萜聯(lián)合GM1組，共5組，每組15只。

除空白對照組外，其余各組腹腔注射亞驚厥劑量戊四氮35 mg/kg，每天1次，持續(xù)28 d，復(fù)制慢性癲癇模型?？瞻讓φ战M以等容生理鹽水腹腔注射。

同時(shí)，癲癇模型組灌胃同體積生理鹽水；靈芝三萜組每天灌胃靈芝三萜1000 mg/kg；GM1組腹腔注射GM130mg/kg；靈芝三萜聯(lián)合GM1組灌胃靈芝三萜1000 mg/kg，腹腔注射GM1 30 mg/kg?？瞻讓φ战M灌胃同體積生理鹽水。灌胃前禁食6 h。

大鼠癲癇發(fā)作評分標(biāo)準(zhǔn)按Ono法[9]：0級，行為上無任何形式的發(fā)作反應(yīng)；Ⅰ級，節(jié)律性點(diǎn)頭或面部抽動；Ⅱ級，陣攣性咀嚼或點(diǎn)頭甩尾；Ⅲ級，頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級：呈袋鼠姿勢或多肢抽動；Ⅴ級，身體失去平衡，甚至傾倒；Ⅵ級，全面持續(xù)強(qiáng)直-陣攣發(fā)作。注射后每天觀察大鼠30～60 min，記錄癲癇發(fā)作的級別，出現(xiàn)連續(xù)5次≥Ⅱ級驚厥發(fā)作即為造模成功。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 Morris水迷宮測試

定位航行實(shí)驗(yàn)：造模成功后次日每組隨機(jī)抽取10只大鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 d。第1天讓大鼠自由游泳1 min后開始訓(xùn)練，每天同一時(shí)段訓(xùn)練4次，訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察記錄大鼠每次自入水至尋找到并爬上平臺所需時(shí)間，即逃避潛伏期(s)。4次訓(xùn)練分別從4個不同入水點(diǎn)入水，如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺，潛伏期記為60 s，每次訓(xùn)練間隔60 s。

空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天進(jìn)行，用于測量大鼠對平臺空間位置的記憶能力。撤走平臺，將大鼠面向池壁任選一個入水點(diǎn)入水，測試大鼠在60 s內(nèi)跨過原平臺所在位置的次數(shù)，同時(shí)記錄在目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.3.2.2 海馬神經(jīng)元病理組織學(xué)檢查

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后，10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，冰上快速斷頭取腦，各組隨機(jī)選取5只大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，95%～75%梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.3.2.3 透射電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

各組再隨機(jī)取3只大鼠腦組織，分離海馬組織，立即放入2.5%戊二醛緩沖液中，參照腦立體定位圖譜將CA1區(qū)海馬組織切成數(shù)個1×1×1 mm小塊，再放入2.5%戊二醛緩沖液，4 ℃冰箱固定2～4 h，常規(guī)包埋，超薄切片，經(jīng)鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液、枸櫞酸鉛，各染色15 min)，透射電子顯微鏡下觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.3.2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

各組其余的7只大鼠斷頭取腦，于冰上用冰生理鹽水漂洗大腦血漬，再用濾紙拭干后取出海馬組織，立即裝入冷凍管中，并將凍存管迅速放入液氮中保存。按AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明提取總RNA，按RNA PCR試劑盒說明進(jìn)行qPCR反應(yīng)，GADPH作內(nèi)參，檢測海馬Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA表達(dá)水平。qPCR引物序列見表1。

表1 目的基因與內(nèi)參照引物序列

反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT法(Livak法)進(jìn)行分析處理，再根據(jù)所得的數(shù)據(jù)計(jì)算出海馬Cofilin、SYN和GAP-43的mRNA相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料均經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以()表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試

定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，各組逃避潛伏期隨時(shí)間有不斷縮短趨勢。與空白對照組比較，各時(shí)間點(diǎn)癲癇模型組逃避潛伏期延長(P＜0.05)；與癲癇模型組比較，各用藥組逃避潛伏期均縮短，部分時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

空間探索實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對照組比較，癲癇模型組穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01)，在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯縮短(P＜0.01)；與癲癇模型組比較，各用藥組穿越平臺次數(shù)均明顯增多(P＜0.01)，在目標(biāo)象限停留時(shí)間明顯延長(P＜0.01)。見表3。

2.2 海馬神經(jīng)元病理組織學(xué)

空白對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，整齊排列，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大而圓；癲癇模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞較少，排列疏松、紊亂，胞質(zhì)深染，胞核溶解碎裂，呈空泡狀；各用藥組海馬神經(jīng)元細(xì)胞較模型組有所改善，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞形態(tài)趨于正常，排列比較整齊，胞核碎裂固縮減少。見圖1。

2.3 海馬組織透射電鏡觀察

空白對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)清楚，形狀規(guī)則，突觸結(jié)構(gòu)、數(shù)量及突觸前后囊泡正常，線粒體等細(xì)胞器形態(tài)正常；癲癇模型組神經(jīng)元細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)不清楚，形狀不規(guī)則，突觸小泡數(shù)量變少，突觸數(shù)量減少，線粒體嵴斷裂，部分嵴消失，細(xì)胞器腫脹變形；各用藥組神經(jīng)元細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)較清楚，突觸結(jié)構(gòu)較完整，突觸小泡數(shù)量增多，突觸數(shù)量增加，線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)有所改善。見圖2。

2.4 海馬Cofilin、SYN、GAP-43 mRNA表達(dá)

與空白對照組相比，癲癇模型組Cofilin mRNA水平上調(diào)(P＜0.05)，SYN mRNA和GAP-43 mRNA水平降低(P＜0.05)；與癲癇模型組比較，各用藥組Cofilin mRNA表達(dá)水平降低(P＜0.05)，SYN mRNA表達(dá)水平升高(P＜0.05)，僅靈芝三萜聯(lián)合GM1組GAP-43 mRNA升高(P＜0.05)。見表4。

表2 各組定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期(s)

表3 各組目標(biāo)象限停留時(shí)間及穿越平臺次數(shù)比較

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)病理組織學(xué)觀察(HE染色，×400)

圖2 大鼠海馬透射電鏡觀察(×5000)

3 討論

癲癇是一種腦部神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致突然、反復(fù)、短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性病[10]，已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦卒中的第二大常見病[10]。癲癇患者伴隨學(xué)習(xí)記憶下降及認(rèn)知障礙，可能與反復(fù)或長時(shí)間癇性發(fā)作致缺氧、乳酸酸中毒及神經(jīng)遞質(zhì)過度興奮，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元代謝及結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)[11]。

靈芝的主要化學(xué)和藥效成分之一靈芝三萜可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]，具有一定程度的抗癲癇作用[5]。外源性GM1也可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13-14]，通過調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信號通路逆轉(zhuǎn)精神障礙引起的認(rèn)知與記憶損傷[15-16]，提示兩藥可能對神經(jīng)元的修復(fù)、再生存在協(xié)同效應(yīng)。本項(xiàng)目組前期研究證實(shí)[17]，靈芝三萜化合物和GM1可以促進(jìn)癲癇后神經(jīng)再生與重塑，從而起到腦保護(hù)的作用。

表4 各組海馬Cofilin、SYN和GAP-43 mRNA表達(dá)比較

Morris水迷宮通過定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)可用來判斷動物對空間定位的學(xué)習(xí)記憶能力[18]。本研究顯示，癲癇模型大鼠學(xué)習(xí)記憶下降與Jiang等[19]用戊四氮點(diǎn)燃大鼠癲癇模型的結(jié)果一致。靈芝三萜和GM1均能改善癲癇大鼠的認(rèn)知能力，特別是空間學(xué)習(xí)記憶能力；但未發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥有更明顯的效果。

海馬是對學(xué)習(xí)記憶最重要的區(qū)域，海馬神經(jīng)元的凋亡、壞死或突觸丟失都會導(dǎo)致認(rèn)知功能特別是學(xué)習(xí)記憶能力障礙[20]。本研究顯示，靈芝三萜和GM1均能改善癲癇引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

神經(jīng)元突觸的功能與結(jié)構(gòu)可隨外界刺激或環(huán)境因素的影響發(fā)生明顯的可塑性變化，神經(jīng)突觸的可塑性變化與癲癇后記憶損傷密切相關(guān)，是癲癇及癲癇后記憶認(rèn)知障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)。SYN作為突觸發(fā)生和突觸重塑的重要標(biāo)志，在身體所有的神經(jīng)末端廣泛表達(dá)，對神經(jīng)生長、修復(fù)再生及突觸重塑有重要作用[21]。GAP-43是神經(jīng)突觸可塑性功能因子，與突觸聯(lián)接建立以及突觸損傷修復(fù)的過程密切相關(guān)。SYN和GAP-43表達(dá)水平與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。張巖等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，海馬中SYN和GAP-43 mRNA的表達(dá)量升高，可改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和認(rèn)知功能障礙。Cofilin是重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架聚合與解聚的因子，參與神經(jīng)損傷、修復(fù)再生過程[23]。Cofilin基因及蛋白水平上調(diào)可以破壞原有的正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，阻礙胞內(nèi)軸漿運(yùn)輸，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元突觸丟失，影響突觸可塑性[24]。在腦損傷防治策略中，可以通過下調(diào)Cofilin、上調(diào)GAP-43的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)軸突再生，進(jìn)而改善神經(jīng)細(xì)胞損傷[25]。

本研究顯示，Cofilin蛋白聚集、SYN和GAP-43表達(dá)降低可能與癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的損害有關(guān)，靈芝三萜和GM1及兩者聯(lián)合用藥可改善癲癇大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其下調(diào)Cofilin mRNA水平，促進(jìn)SYN和GAP-43的mRNA表達(dá)，從而提高突觸修復(fù)及再生能力有關(guān)。作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。聯(lián)合用藥未發(fā)現(xiàn)更明顯的效果。